石油污染土壤的微生物修复技术 综述

石油污染土壤的微生物修复技术
摘要：石油是现代工业的重要能源，但各种泄露事故造成越来越严重的环境污染，并且石油对土壤的污染有着与独特的特征。

解决土壤石油污染的方法有物理修复、化学修复和生物修复，其中石油污染土壤的微生物修复技术以其高效、环保等优点备受关注。

选择具有高效降解能力的微生物是治理石油污染的关键环节，目前主要集中在土著微生物的分离筛选、构建高效降解能力的微生物菌群、以及构建基因工程菌。

生物强化技术是通过接种高效降解菌株(群) 或增加营养盐、表面活性剂等方式提高微生物代谢活动以去除污染物的过程。

石油污染土壤的微生物修复技术已经被用于工程实践，按修复的地点又可分为原位生物修复和异位生物修复。

本文在最后对石油污染土壤的微生物修复技术进行了展望。

关键词：石油污染土壤，微生物，修复技术
Bioremediation Technology of Soil Contaminated
by Petroleum
Abstract：Oil is the important modern industrial energy, but a variety of leak caused serious environmental pollution, and oil pollution of the soil has its’unique characteristics. To solve the oil contamination in soil, physical repair、chemical remediation and bioremediation have applied, microbial remediation of petroleum contaminated soil with its high efficiency、environmental protection and other advantages of concern. Effectively degrade microorganisms are the key aspects of the treatment of oil pollution, mainly concentrated in the indigenous microbial screening, constructing of microorganism flora with high efficiency degradation, and constructing genetic engineering bacteria. Bioaugmentation technology is efficient degradation by vaccination strains (group) or to increase the nutrient, a surface active agent to improve the microbial metabolic activity to remove pollutants in the process. Microbial remediation of petroleum contaminated soil has been used in engineering practice, according to the location of the repair, it can be divided into in situ bioremediation and ectopic bioremediation. Article in last prospect microbial remediation of petroleum contaminated soil.
Key words: Soil contaminated by petroleum，Microorganism ，remediation technology
一、石油污染土壤特征
1.1土壤污染
土壤污染是指人类活动所产生的物质(污染物)，通过多种途径进入土壤生态系统，其数量和速度超过了土壤容纳的能力和土壤净化速度的现象。

土壤污染可使土壤的性质、组成及性状等发生变化，使污染物质的积累过程逐渐占据优势，破坏土壤的自然动态平衡，从而导致土壤正常功能失调，土壤质量恶化，影响作物的生长发育，造成产量和质量的下降，并可通过食物链引起对生物和人类的危害，甚至形成对生命系统的超地方性的危害[1]。

由于土壤的污染源十分复杂，所以土壤污染物的种类也极为繁多。

通常将进入土壤中并影响土壤正常作用的物质，即会改变土壤的成分、降低农作物的数量或质量、有害于人体健康的那些物质，统称为土壤污染物。

按污染物性质大致可分为：①有机污染物，主要是化学农药、除虫剂、石油、多环芳烃等；②重金属．主要是汞、锅、铅、砷、铜、锌、钻、镍、硒等；③放射性物质，主要是铂、铝、铀等；④垃圾和其他废弃物；⑤病原微生物。

1.2石油污染土壤的特征与危害
石油素有“工业血液”之称，是现代工业的重要能源之一。

然而，随着石油使用量的增加，在石油勘探、开采、运输和储存过程中，由各种泄露事故造成的环境污染越来越严重[2]。

据有关资料显示，全世界每年有近800万t石油污染物进入环境，我国每年约有60万t石油污染物进入环境[3]。

这些污染物通过各种途径进入土壤，降低土壤透气性，改变土壤养分组成和结构，影响土壤微生物群落结构，减少作物产量[4-7]。

污染土壤中石油主要成分为C15~C36的烷烃多环芳香烃烯烃苯系物酚类等，其中环境优先控制污染物多达30种[8]。

石油对土壤的污染有着与其它土壤污染不同的特征，石油流入土壤灌满一定深度土壤空隙，影响土壤的通透性，改变土壤有机质的组成和结构，影响土壤中微生物的生长，也影响土壤中植物根系的呼吸及水分养料的吸收，甚至使植物根系腐烂坏死，严重危害植物的生长。

且土壤中的石油随土壤中水的运行而运行不断地扩散到它处或深处。

此外，因为石油富含反应基，能与无机氮、磷结合并限
制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有机氮、磷的含量减少，影响作物的营养吸收。

石油是混合物，其中烃不易被土壤吸附的部分能渗入地下水、污染地下水，导致地下水水质恶化。

石油中的某些苯系物质和多环芳烃具有致癌、致病变和致畸形等作用。

这些污染土壤中的物质，经食物链的传递进入人体，在人体中积累，当积累的量达到人体所能承受的最大程度时，则严重危及人体的身体健康甚至危害生命。

二、微生物降解石油烃的特点及机理
2.1原油污染土壤的生物修复技术
污染土壤的生物修复技术是指利用特定的生物（植物、动物微生物）吸收、转化降解或清除环境污染物，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施。

生物修复技术已成为生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术之一，被美国国家环保局（USEPA）推荐作为原油污染土壤修复的首选措施[9]。

1989年石油公司的油轮在阿拉斯加海湾发生的溢油事故中，在采用热水清洗等方法无法奏效情况下，用原位生物降解法对污染的160km海滩的有效治理，初步显示了生物修复技术的实用性[10]。

目前，解决土壤石油污染的方法有物理修复、化学修复和生物修复。

传统的物理、化学修复成本高，且处理不当会引起二次污染，或者仅仅使污染物从一个环境体系转移到另一个体系[11]。

生物修复是指利用生物学方法将存在于环境中的有机污染物降解成CO2和H2O或其他无害物质的过程[12]。

石油污染土壤的微生物修复技术以其高效、环保等优点备受学术界关注。

2.2 微生物降解石油烃的机理
石油烃是链烷烃、环烷烃、芳香烃的复杂混合物。

链烷烃的代谢机理是脱氢作用、羟化作用和过氧化作用[13]。

通常正烷烃的生物降解是由氧化酶酶促进行的,首先烷烃氧化成相应的伯醇,然后经由醛转化成脂肪酸,脂肪酸通过β-氧化降解成乙酰辅酶A, 后者或进入三羧酸循环, 分解成CO2 和H2O,并释放出能量,
或进入其他生化过程。

链烷烃也可直接脱氢形成烯烃,烯烃再进一步氧化成醇、醛,最后形成脂肪酸; 或氧化成为一种烷基过氧化氢,然后直接转化成脂肪酸。

有的微生物还可以通过亚末端氧化形成仲醇,再依次氧化成酮、酯,酯水解形成伯醇和脂肪酸,再进一步氧化分解。

一些微生物能将烯烃代谢为不饱和脂肪酸并产生某些双键的位移或产生甲基化,形成带支链的脂肪酸,再进行降解。

环烷烃是石油烃中难于被微生物降解的烃类。

环烷烃没有末端甲基,它的生物降解原理和链烷烃的亚末端氧化相似,经混合功能氧化酶氧化后产生环烷醇,然后脱氢形成酮,再进一步氧化得内酯,或直接开环生成脂肪酸。

苯与短链烷基苯在脱氢酶及氧化还原酶的作用下,经二醇的中间过程代谢成邻苯二酚和取代基邻苯二酚。

后者可在邻位或间位处断裂,形成羧酸。

多环芳烃（PAHs）的降解首先通过微生物产生的加氧酶进行定位氧化反应。

真菌产生单加氧酶,将氧原子加到苯环上,形成环氧化物,然后加入H2O产生反式二醇和酚;细菌产生双加氧酶,将两个氧原子加到苯环上,形成过氧化物,然后氧化成顺式二醇,脱氢产生酚。

环的氧化是微生物降解多环芳烃的限速步骤。

不同的代谢途径有不同的中间产物,但普遍的中间代谢产物是邻苯二酚、2, 5-二羟基苯甲酸、3, 4-二羟基苯甲酸。

这些代谢物通过相似的途径降解:环上的碳键断裂,经丁二酸、反丁烯二酸、丙酮酸,生成乙酸或乙醛。

代谢产物一方面可被微生物用于合成细胞成分,一方面也可氧化成CO2和H2O[14]。

2.3石油污染土壤微生物修复的特点
微生物修复技术是微生物起主导作用的方法，即在人为强化的条件下用自然环境中的土著微生物或人为投加外源微生物对环境中的石油污染物进行转化、降解与去除[15－16]。

微生物具有种类多、繁殖快、比表面积大、易变异等特点，因此微生物修复与传统物理、化学修复相比，具有诸多优点: ( 1) 成本低; ( 2) 修复效果优; ( 3) 污染物的氧化反应完全，不引起二次污染; ( 4) 不破坏土壤生态环境; ( 5) 可进行原位修复处理，操作简单。

石油污染土壤的微生物修复可以通过改变外界条件( 包括温度、湿度、盐分、通气量、养分含量和添加表面活性剂等) ，也可以通过生物强化修复，接种驯化获得的高效降解菌株( 菌群) 来提高土壤中石油的降解速率[17-18]。

但是，该技术
对难降解化合物( 如高分子芳香烃类化合物和石蜡、沥青等物质) 的降解效果以及在采油区贫营养型土壤中的适用性等尚需深入研究。

三、具有高效降解能力的微生物选择
3．1土著微生物的筛选
自然界中具有降解烃类化合物能力的微生物约占微生物总数的1%，由于石油污染物的存在，具有降解烃类化合物能力的微生物可增加到10%[19]。

对降解石油烃类化合物起重要作用的细菌包括芽孢杆菌属( Bacillus) 、假单胞菌属( Pseudomonas) 、微球杆菌属( Micrococcus) 、黄杆菌属( Fla-vobacteria) 、诺卡氏菌属( Nocardio) 、不动杆菌属( Acinetobact-er) 、气单胞菌属( Aeromonas)和产碱杆菌属(Alcaligenes) 等，真菌包括木霉属( Trichoderma) 、曲霉属( Aspergillus) 和青霉属( Penicillium) 等。

Sood 等从印度Digboi 冶炼厂油泥中分离获得1 株可降解石油烃的假丝酵母菌，该菌株可以在pH 值为3 的强酸性条件下 1 周内降解石油烃达75%[20]。

司美茹等从山东胜利油田附近石油污染土壤中分离获得 1 株石油降解菌，经鉴定该菌株为链霉属白孢类群，其药瓶培养的石油降解率为66.4%[21]。

通常微生物对石油中特定成分和结构有较强的专一性，因此，石油污染土壤的微生物修复需要由多种石油烃降解菌协同完成。

Richard 等通过富集培养获得7 株以柴油为碳源的石油烃降解菌，其中3 株菌对芳香烃和脂肪烃类物质有降解作用，4 株对石油烃类化合物无降解作用，但可以加速其余 3 株菌对石油的降解[22]。

崔志松等以两种海洋专性解烃菌构建石油降解菌群,采用多种手段分析、比较降解菌纯培养和降解菌群对原油的降解率及石油降解后产物的多元色谱图。

结果显示构建的降解菌群中2种专性解烃菌具有明显的协同效应[23]。

3.2构建基因工程菌
随着现代分子生物学的发展，通过现代生物工程技术定向改造微生物菌株可获得工程菌。

工程菌具有高效、适应性强等优点，可以同时降解土壤中多种石油
烃类污染物。

1999年，Ckibe 等克隆了 1 株石油降解菌的醛脱氢酶( aldehyde de-hydrogenase) 基因，并在大肠杆菌中成功表达[24]。

2003 年，Colyshin 等成功破译了1 株石油降解菌的基因组[25]。

2007年，我国首次完成了1 株采油微生物的全基因组破译，揭示了其遗传信息并首次发现其重要代谢路径[26]。

2011 年，段晓芹等从石油污染土壤中分离获得 1 株 3 －苯氧基苯甲酸降解菌，并将拟除虫菊酯类杀虫剂水解酶基因导入该菌，使其对甲氰菊酯及其中间产物的降解能力优于原始菌株[27]。

在石油污染土壤中，微生物的种类及群落结构是影响石油降解速率的重要因素，通过筛选获得高效降解石油的微生物菌株或菌群可以明显提高污染区修复效果。

但是，目前工程菌的研究也处于探索阶段。

加之不同石油污染区的地理环境、水文气象等因素差异较大，微生物修复菌株的选择和菌群的组合也有所不同，使得微生物修复技术尚无统一的标准，大规模推广应用受到了一定的限制。

四、生物强化技术
微生物强化( microbial augmentation) 是在生物处理过程中，通过接种高效降解菌株( 群) 或增加营养盐、表面活性剂等方式提高微生物代谢活动以去除污染物的过程。

Bento 等对自然衰减、生物刺激和生物强化修复石油污染土壤的效果进行了评价，结果表明生物强化处理石油组分中重油和轻质油的降解率均达到70%以上，修复效果显著优于其他处理[28]。

石油污染土壤微生物修复过程中，生物强化可以显著提高土壤中石油烃降解微生物的生物量和酶活性[29-30]。

刘其友等考察投加复合菌株CM-13是否能够加速生物修复进程以及土壤中石油污染物质降解的影响因素，优化了盐渍化石油污染土壤的微生物强化修复技术，效果良好[31]。

郭超等研究表明高效石油降解菌可以使石油污染土壤中石油烃类化合物快速分解，营养成分和石油烃浓度是石油烃降解菌生长的重要因素[32]。

Nikolopoulou 等研究表明，生物表面活性剂可以提高石油烃化合物的降解效率( 18 d 降解率达到96%) ，缩短微生物停滞期( 添加生物表面活性剂 1 周内降解率达到80% )[33]。

张坤等在油－盐混合污染耕地的耕作层中施加麦秸以强化微生物对石油烃类化合物的降解，结果表明当麦秆添加量为5%时，土壤中细
菌和真菌生物量最高，45 d 后，石油烃降解率达到75%[34]。

石油及其加工产品通常以非水相液体污染土壤，利用多孔性物质固定微生物可以为微生物提供充足的氧气、养分和水以强化微生物对石油污染土壤的修复。

Liang 等利用活性碳和沸石作为载体强化修复石油污染土壤，显著提高了微生物量和石油烃降解率[35]。

刘媚媚等以活性炭纤维为固定化载体强化微生物对石油的降解，结果发现石油去除率平均提高26%[36]。

石油污染土壤的生物强化修复是目前研究较多的修复技术之一，学术界对于它的修复效果存在争议，有研究表明利用真菌、细菌单菌株和真菌菌群强化石油多环芳烃类化合物降解，萘、蒽、菲及大分子芳香烃类化合物的降解速率无显著变化[37]。

微生物强化实质是一系列生物化学反应，反应的进程受菌株( 群) 的多样性、环境的异质性和临界参数( 如湿度、生物捕食作用和生物利用率等) 的变化等因素影响，因此，在实际操作过程中，应该考虑污染区的生物和非生物因素，才能发挥生物强化的修复效果。

五、微生物修复技术的工程化应用
石油污染土壤的微生物修复主要利用土壤中的土著微生物或向污染环境补充经驯化的高效微生物，在优化的环境条件下，加速分解污染物，修复被污染的土壤。

微生物修复按修复的地点又可分为原位生物修复和异位生物修复。

5.1原位生物修复技术
5.1.1土壤堆腐法
土壤堆腐法是一种和土地耕作法相似的生物修复过程，与土地耕作法的不同之处在于其加入了土壤调理剂，以提供促进微生物生长和石油生物降解的营养元素，促使天然微生物降解石油污染物，从而达到生物修复的目的。

加入的物质或调理剂，可以是堆肥产物、市政污泥、牛粪、壳质素、农作物、植物茎秆、锯屑、发酵残渣和腐植酸等多种营养物质。

这些物质都是廉价的，有些甚至是废弃物，将这些物质用于土壤修复，既可达到修复目的，还有效降低了修复成本[38]。

Sarker 等[39]研究，在柴油污染土壤中添加果蔬及菜园下脚料等堆肥的处理效果，12周后土壤含油量下降了85%。

Wan Nam koong等[40]在柴油污染土壤中分别添加污
泥和有机肥料堆肥的修复效果，石油烃（TPH）的降解率，超过95%。

20世纪80-90年代，国外开始尝试用堆肥法处理土壤中有机物，目前，该方法在许多国家和地区都得到了广泛的应用。

5.1.2生物通气法
生物通气法[41]是一种强迫氧化的微生物降解方法，被称为土壤修复革命性技术。

在污染土壤上至少打2口井，安装鼓风机和抽真空机，将空气强排入土壤中，然后抽出，土壤中挥发性的有毒有机物也随之去除。

同时，也为促进原位生物降解创造好氧条件。

其优点是不破坏土壤结构；设计、安装简便易行；应用范围较宽，不仅能清除挥发组分，还能用于半挥发组分及重组分有机物最终产物是CO2、H2O和脂肪酸，环境副作用小。

1988年底，生物通风技术首次应用在美国犹他州的空军基地，处理约90t航空燃料油的泄漏污染，生物降解达到85%-90%[42]。

1992-1995年，美国空军部已在130多个地点应用了生物通风进行土壤修复。

张丙印等[43]通过建立气体渗流场、污染物相间交换以及污染物随气流场运移3个主要过程的物理和数值模型，对生物通气修复系统清除污染物过程进行数值模拟研究。

王喜等[44]通过测试污染物在不同均质土质中的扩散速，结合试验现场土壤的土质条件和含水率，探讨了优化场地生物通风流量的方法国外学者对生物通风的修复研究，目前，原位生物通风修复方法主要集中在生物通风数值模拟模型开发、优化及其在现场修复系统设计、运行过程中的应用等方面。

5.2异位生物修复技术
异位生物修复主要包括现场处理法、预制床法、堆制处理法、生物反应器和厌氧生物处理法
5.2.1预制床法
预制床法是指在不泄漏的平台上，铺上石子和沙子，将受到污染的土壤以15-30cm的厚度平铺其上，加入营养物和水，必要时也可加一些表面活性剂，定期翻动土壤补充氧气，以满足土壤中微生物生长需要。

这一技术被视为具有广阔的应用前景。

中科院南京土壤研究所[45]通过添加有机肥、调理剂、接种烃降解菌以及搭建温室等方式对某油田的含油污泥进行了大规模的预制床生物修复，结
果表明,经过230d的修复,不同修复处理油泥中的油和脂含量降低了46.3%。

5.2.2堆制处理法
土壤的堆制处理就是将受污染的土壤从污染地区挖掘起来，防止污染物向地下水或更大的地域扩散．运输到一个经过处理的地点(布置防止渗漏底，通风管道等)堆放，形成上升的斜坡，并进行生物处理。

堆制法是生物修复技术中的一种新型替代技术。

堆制处理过程对污染土壤中的多环芳烃降解，多环芳烃的降解随着苯环数的增加而降低。

当多环芳烃的初始浓度提高约50倍时，除荧、蒽外，其他多环芳烃的降解随着污染浓度的提高而降低。

5.2.3生物反应器法
生物反应器法是将污染土壤置于一专门的反应器中处理。

生物反应器一般建在现场或特定的处理区。

通常为卧鼓形和升降机形，有间隙式和连续式两种。

因为反应器可使土壤与微生物及其他添加物如营养盐，表面活性剂等彻底混合，能很好的控制降解条件，因而处理速度快，效果好。

生物反应器处理的过程为：先挖出土壤与水混合为泥浆，然后转入反应器。

为了提高降解速率，常在反应器先前处理的土壤中分离出已被驯化的微生物，并将其加入到准备处理的土壤中．
5.2.4厌氧生物修复法
修复受石油烃污染土壤的研究已开发了生物堆层、堆肥及土壤泥浆反应器等好氧修复工艺，但分离获得某些降解菌时。

一些降解菌伴有产生高生态风险的产物。

最近的研究表明以厌氧还原脱氯为特征的厌氧微生物修复技术有很大的潜力。

六、结语
石油烃类污染物的微生物降解是一个复杂的过程,它的效率和质量取决于石油烃类污染物存在的数量及状态、周围的环境条件以及微生物群落的组成。

近几年国内外在研究石油烃类污染物生物治理方面取得了显著的成效。

但还有很多问题需要解决,如各种高效降解菌的筛选和纯化研究比较散乱,微生物降解机理研究相对不足。

此外,还应注重相关学科的交叉与渗透,比如微生物与动植物协调作用、生命科学与地球物理化学有机结合等。

最后应注重新技术的工业化。

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