浅析细胞培养生产紫杉醇的影响因素及对策

浅析细胞培养生产紫杉醇的影响因素及对策
摘要：紫杉醇是一种有效治疗多种癌症的天然植物，具有高效、低毒、广谱、作用机制独特等特点，然而不断增长的抗癌药物需求和红豆杉资源的缺乏，为紫杉醇的工业化生产带来了很大压力，利用植物细胞培养生产紫杉醇被公认是一种有效的途径。

本文着重阐述了一些因素对紫杉醇产量的影响，以及利用生物反应器进行细胞培养时存在的问题，并针对这些影响因素给出了相应的对策。

并提出提高紫杉醇产量的方法，在文章最后给出了一些建议。

关键词：红豆杉紫杉醇细胞培养影响因素对策
利用细胞悬浮培养方法提取紫杉醇是近年来红豆杉研究的一个重要课题。

自1989年首次报道细胞培养法生产紫杉醇以来，各国学者开展了广泛研究，目前细胞培养已经取得了较大进展，但还存在诸多需要克服的技术性难题。

紫杉醇是红豆杉属植物的次级代谢物，植物细胞培养生产次级代谢产物包括两个重要环节，一是细胞生长，二是产物合成。

这两个环节的任何影响因素都会影响到生产效率。

具体因素包括生物因素、物理因素和化学因素。

另外，本文还阐述了反应器对实验的影响及一些反应器的结构创新。

一、生物因素
1、细胞株
大量的研究表明，植物细胞的分化与次生代谢物的合成有密切的关系。

这些分化不但包括整植株、器官、组织，还包括细胞和亚细胞水平的分化。

分化的细胞、组织、器官往往有较高含量的次生代谢物。

因此，在生物反应器中通过大规模培养分化组织、器官、甚至整个植株可以生产次生代谢物。

目前，植物细胞培养所采用的培养物有细胞团块、绿色愈伤组织、冠瘿组织、不定芽（原基）、茎段、正常根、毛状根、畸形芽、胚（胚状体）甚至整个小植物。

2、褐变
红豆杉属植物愈伤组织的诱导、继代培养过程中，细胞会分泌大量的棕色色素物质，这些色素物质的积累会影响愈伤组织生长，愈伤组织受毒害而逐渐转为暗褐色至黑色，这种现象称为褐变。

该现象与常见的木本植物培养初期发生褐变不同,后者通过选用较小外植体、频繁继代等一般可以克服,且以后不会发生;而就红豆杉而言,无论何种外植体来源的愈伤组织,常连续发生褐变,严重时会抑制细胞的增殖生长以至致死,使用抗氧化剂、吸附剂等多种方法,都只能减轻褐化[1]。

通过研究表明：培养基中附加0.1-0.5mg/LBA,对愈伤组织生长量的增加、保持质地,尤其是抑制褐化效果明显[2]。

二、物理因素
1、光照
黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成，紫杉醇的产量高于光照条件下的3倍。

2、温度
温度会影响酶的活性，细胞生长速率与培养温度紧密相关。

愈伤组织诱导与培养的适宜温度为20～25℃。

3、PH
PH会影响培养液的渗透压、酸碱度、从而影响细胞代谢。

培养基灭菌前pH5.8左右。

4、剪切力
在悬浮培养中，植物细胞比微生物细胞对培养液的剪切力更敏感，因此开发适合植物细胞培养的新型生物反应器是进入工业化生产的必要前提之一。

钟建江等开发了一种新型离心浆搅拌式生物反应器，具有剪切力小的特点。

中国红豆杉悬浮细胞在离心搅拌浆和常规搅拌浆两种不同反应器中虽然两者的细胞比生长速度大致相同，但在常规搅拌浆反应器中，细胞
延迟期较长，且细胞严重附于反应器上，不利于培养，而离心搅拌浆则无此缺点。

红豆杉细胞在气升式反应器中培养鲜重的倍增时间为7.68d，比在机械搅拌式反应器中的倍增时间8.15d要短，并且紫杉醇的积累也较高，而且气升式反应器剪切力较小，气体传递良好，因此气升式反应器比搅拌式反应器更适合于红豆杉细胞培养。

Son等研制了一种气球型气泡式生物反应器（Balloon7type bubble bioreactor，BTBB)，并与其它几种不同类型的生物反应器进行了比较研究，结果表明BTBB最适合红豆杉细胞培养，在500L的反应器中，紫杉醇的产量达到3mg/L
4、溶解氧
JLuo等在20升的生物反应器中研究了溶解氧对紫杉醇产量的影响。

他们在最初20天的细胞培养中，将反应器中的溶解氧浓度控制在60%，然后在细胞培养的最后12天里，将溶解氧浓度降低到20%，结果得到紫杉醇的最大产量为18.7毫克/升。

进一步的研究发现，在最后的12天用低浓度的溶解氧有利于生成紫杉醇的原因是，在这一时期，紫杉醇的合成大部分被氧饥饿所刺激或者是因为溶解氧的减少导致了挥发性气体——乙烯的增加，它作为胁迫因子刺激了紫杉醇产量的提高。

三、化学因素
化学因素的影响主要是通过合适的培养基选择来控制，包括前体物质、诱导子、抑制剂等。

1、前体物质
前体物质是细胞内合成紫杉醇的反应物 ,细胞内的许多生物反应是酶促条件下的可逆化学反应 ,如果增加参与反应的物质的量 ,就可使平衡向着生成物的方向移动 ,从而生成更多的产物。

Fett- Neto[3]通过研究发现苯丙氨酸( Phe)、苯丙甲酸、甘氨酸( Gly)、丝氨酸(Ser)均能显著促进东北红豆杉细胞紫杉醇的合成,其最好的结果为:添加苯甲酸提400 % ,添加丝氨酸提高 250 %。

甘烦远等[4 ]发现添加适量 Phe、亮氨酸(Leu) 或巴卡亭Ⅲ均能提高云南红豆杉细胞紫杉醇含量,但对培养细胞的生长率作用不大。

陈永勤等[5]在培养细胞中加入 Phe、乙酸钠、丙酮酸钠和香叶醇,发现Phe能促进细胞生长和紫杉醇的合成,乙酸钠对细胞生长和紫杉醇含量均无影响 ,而丙酮酸钠和香叶醇能提高紫杉醇含量,不能促进细胞生长。

吴奇君等[6]发现加入前体物质的时间对东北红豆杉细胞紫杉醇含量也有影响 ,对数生长期(大约培养后的15d)加入前体物质比其他时期加入的效果要好。

目前已在研究中使用过的前体物质主要是有: Gly、Ser、Phe、Leu、丙酮酸、苯甲酸钠、3-甲基-2 -丁烯-1-醇等。

前体饲喂细胞一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率,另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行,有效提高紫杉醇产量。

2、诱导子
诱导子是一类能使植物产生特征性自身防御反应的物质,加入诱导子能提高紫杉醇含量 ,可能是因为防御反应途径与紫杉醇代谢有一段共同的代谢途径,这些物质的加入,可以激活共同途径中某些酶类的活性,从而促进代谢通量和代谢速率。

因此 ,在某种意义上讲 ,加入诱导子也等于增加前提物质。

诱导子主要有茉莉酸甲脂(MJ)、水杨酸(SA)、人参寡聚糖、几丁质、纤维素酶、茉莉酮酸、真菌诱导子、HgCL2等。

诱导子提高紫杉醇含量的作用十分明显 , Zhen-YuWang等研究了将茉莉酸甲酯和条件培养基共同加入对紫杉醇产量的影响。

结果表明，当只加入条件培养基时，可增加细胞的生长速率，其值为0.125毫克/升·天；在第11天时，紫杉醇的最高含量为（5.4±1.2）毫克/克；细胞最大生长速率达到（4.5±1.2）毫克/升·天。

然而，若是在第8天时加入100微摩尔的茉莉酸甲酯，则在第14天时细胞生长速率为0.162毫克/升·天，最大含量为（12.7±1.2）毫克/克，细胞最大生长速率为（11.8±0.9）毫克/升·天。

Mirijalili 和 Linden等[32]发现10μmol/ L的MJ和5 mg/ L的乙烯可使东北红豆杉悬浮细胞的紫杉醇产量提高19倍。

Yukimune等[ 7]在培养第0天加入
100μmol/L的MJ使杂种红豆杉、欧洲红豆杉和短叶红豆杉分别提高了4和2.5倍。

但有些诱导12子表现对细胞毒害和延长细胞生长的作用 ,如水杨酸。

3、抑制剂
抑制剂是一类可阻止紫杉醇合成的前体物向其他方向代谢的物质。

抑制剂主要有单萜合成抑制剂,如α-蒎烯、松油醇、樟脑 ,甾体合成抑制剂氯化胆碱( CCC)。

添加抑制剂能够反馈抑制分支路径而使反应向有利于紫杉醇合成的方向进行。

发现合成代谢抑制剂氯化胆碱CCC可以使紫杉醇含量提高，但浓度过高却抑制合成。

[8]
四、反应器
植物细胞培养所用的培养设备大部分是由微生物发酵罐改进而来的，但因植物细胞与微生物相比颗粒较大、易聚集、生长慢、培养周期长、抗剪切力差、抗污染力弱，所以植物细胞对环境条件的要求更高。

摇瓶对于实验操作而言，具有廉价、操作方便等优点，而对于应用于工业生产目的的反应器，威尔逊鼓泡式反应器因简单易行且可以连续操作而受到重视。

Pestchanker等比较了摇瓶和威尔逊反应器中东北红豆杉细胞的生长情况，结果发现，培养21天后，两种反应器中紫杉醇的效价相同。

在威尔逊鼓泡式反应器中，细胞对营养物质(糖、氮、钙等)吸收较快，21天时，细胞鲜重为135毫克/天，而摇瓶中细胞产量为310毫克/天。

研究人员认为，这可能是由于威尔逊反应器器壁上易形成生长环带，影响了细胞鲜重的测定。

Seki等证明，在灌注式培养反应器中，由于高度稀释，使细胞生长受到抑制。

在培养第19天，稀释度为0.9升/天时，成批培养细胞比生长速率为2.1，而在灌注式培养反应器中培养细胞比生长速率为1.9。

但与前者相比，后者紫杉醇的产量有所增加。

大部分植物细胞在微生物发酵罐中均不能正常生长代谢或培养后期染菌率高，项目研发人员对发酵罐进行了多处改进：罐体结构；改进气体分布器结构；改进搅拌桨结构；更换搅拌电机以低速运转；改进接种和取样方式等。

通过综合结构改进，延长了气体在罐内停留时间、增加了溶氧、减少了剪切、降低了污染率，实现了培养规模的顺利放大和产量的提高，开发出了一套适合植物细胞培养的反应器(专利号：ZL01276020．X)。

研究人员采用SonSH等研制的一种综合气升式和流化床反应器特点的发泡生物反应器培养红豆杉胚源细胞株时发现，在20升小规模培养反应器中培养的基础上，在100~150升反应器中培养具有良好的重现性，能够大幅度提高紫杉醇的产量。

【建议】在提高紫杉醇含量方面 ,首先需要弄清红豆杉的整个代谢网络 ,找出相关基因及酶 ,利用分子生物学的有关技术调控有关酶的活性或数量,使整个代谢流最大限度朝着合成紫杉醇的方向进行,减少其它不必要的代谢支路,使紫杉醇代谢流速增加。

另外,将化学合成与生物转化技术结合是值得考虑的一条方法 ,生物转化是利用生物体系的催化作用将外源底物转化为产物的过程 ,利用生物转化可以进行化学方法难以进行的反应,可以减少化学合成步骤 ,提高合成效率。

参考文献：
[ 1 ]夏铭,吴绛云,张丽梅.红豆杉组织培养中褐变问题的研究.生物技术,1996;16(3):18-20。

[ 2 ]张宗勤,杨建英,吴耀武.南方红豆杉组织培养及紫杉醇的产生.西北植物学报1998,18(4):488—492。

[ 3 ] Fett - Neto A G ,Melasan S J ,Nicholso n S A ,et al. Imp roved taxol yield by aromatic carbo xylic acid and a mino acid feeding to cell cult ure of taxus cuspidate[J ] . Biotech Bioeng ,1994 ,44 ( 8) :967 - 971.
[ 4 ] 甘烦远 ,彭丽萍 ,郑光植 . 云南红豆杉细胞培养中紫杉醇的代谢调控 [J ]. 云南植物研究 ,1996 ,18 (4) :451 - 453.
[ 5 ] 陈永勤 ,朱蔚华 ,吴蕴祺 ,等 . 前体化合物与化学诱导子对云南红豆杉细胞生长
和产生紫杉醇的影响 [J ] . 湖北大学学报 ,2000 ,22 ( 1) :91 - 94.
[ 6 ] 吴奇君 ,梅兴国 ,周忠强 . 果糖和前体物质对紫杉醇生物合成的影响 [J ]. 生
命科学研究 ,2001 ,5 ( 2) :146 - 148. et hylene interactio n and induction models[J ] .
Bitechnol Prog ,1996 ,12 (1) :110 - 118.
[ 7 ] Yukimune Y , Tabata H , Higashi Y ,et al. Met hyl jasmonate - induced overp
roduction of paclitaxel and bac Ⅲ in Taxus cell suspension cult ures[J ] . Nat ure Biotechnology ,1996 ,14 :1129 - 1132. 2001 ,14 (2) :19 - 21.
[ 8 ]李先良 ,赵志常. 紫杉醇生产方法的研究. 荆门职业技术学院学报.2006 , 5 (3) A 1008 - 4657 ( 2006) 03 - 0091 – 06.。