万古霉素高产菌株选育及发酵配方优化

万古霉素高产菌株选育及发酵配方优化作者：王会会程启东戴梦赵建强任风芝葛鹍鹏张志江
来源：《河北工业科技》2022年第03期
摘要：為了提高东方拟无枝酸菌产万古霉素的发酵单位，降低生产成本，采用紫外诱变、常压室温等离子体诱变对东方拟无枝酸菌出发菌株V19-02进行诱变处理，通过筛选链霉素抗性突变菌株，选育高产菌株;通过对发酵培养基中碳源和氮源进行筛选，选取葡萄糖、淀
粉、低温豆粉、酵母粉4个因素进行均匀设计。

结果表明，获得的高产菌株V19-1-07摇瓶发酵单位提高33.7%，且具有良好的传代稳定性;优化后的培养基配比质量分数为葡萄糖8.0%、淀粉1.0%、低温豆粉1.0%、酵母粉4.0%、氯化钠1.0%、磷酸二氢钾0.1%;小试结果证明，优化配方可使50 L罐发酵单位平均达到14 110 μg/mL，比原始配方提高了28.9%。

因此，研究获得的高产菌株V19-1-07可应用于万古霉素工业化发酵生产，以帮助企业降低成本，进一步提高竞争力。

关键词：发酵工程;万古霉素;复合诱变;菌种选育;均匀设计;东方拟无枝酸菌
中图分类号：TQ465.9 文献标识码：A
DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx03011
Breeding of high vancomycin producing strains and optimization of fermentation formula
WANG Huihui1，2，3，CHENG Qidong4，DAI Meng1，2，3，ZHAO Jianqiang4，REN Fengzhi1，2，3，
GE Kunpeng1，2，3，ZHANG Zhijiang4
（1.New Drug Research & Development Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;2.National Engineering Research Center of Microbial Medicine，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;3.Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;4.Huasheng Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China）
Abstract：In order to increase the yield of vancomycin by Amycolatopsis orientalis and reduce the cost，the original strain Amycolatopsis orientalis V19-02 was treated by UV and atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）.High yield strains were selected by screening streptomycin resistance treatment.Meanwhile，the carbon sources and nitrogen sources of fermentation medium were optimized and four factors including glucose，starch，low-temperature soybean powder and yeast powder were selected for uniform design experiment.The results show that the yield of vancomycin fermentation of the high-yield mutant strain Amycolatopsis orientalis V19-1-07 is increased by 33.7% in flask culture.In addition，the strain has an excellent propagating stability.The optimal fermentation medium is as follows：glucose 8.0%，starch 1.0%，low-temperature soybean powder 1.0%，yeast powder 4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1%.The experimental results show that the production of vancomycin reachs 14 110 μg/mL under the op timal conditions by the strain V19-1-07 in 50 L fermentor，which is 28.9% higher than the original formula.After applied to large-scale production，it is conductive to reduce the cost and improve the competitiveness of enterprises further.
Keywords：
fermentation engineering;vancomycin;complex mutagensis;strain breeding;uniform
design;Amycolatopsis orientalis
万古霉素（vancomycin）由东方拟无枝酸菌发酵所得，其通过抑制细菌的生长和繁殖来杀死细菌[1]，是临床上用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的严重感染疾病的重要药物[2]。

万古霉素的应用日渐增多，在巨大的市场前景下，提高发酵单位、降低生产成本，有利于企业在竞争中占据有利地位[3-4]。

中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。

江苏海阔生物医药有限公司[5]采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9 g/L，且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7%;北大方正集团有限公司等[6]通过在发酵过程中每天补加0.1%～0.5%（质量分数）的硫酸铵，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可达到10 157 μg/mL。

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效[7]。

关亚鹏等[8]应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基，进一步提高万古霉素的发酵单位。

1 材料
1.1 菌种
研究所用菌种为东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 培养基
1）种子培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为20.0 g/L，蛋白胨为5.0 g/L，NaCl为5.0 g/L，K2HPO4为0.3 g/L，pH值为
7.0～7.2。

2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为30.0 g/L，工业淀粉为80.0 g/L，酵母粉为10.0 g/L，低温豆粉为15.0 g/L，NaCl 为1.0 g/L，KH2PO4为0.1 g/L，pH值为7.0～7.2。

1.3 主要原材料和仪器设备
1）原材料
葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。

2）仪器设备
发酵摇瓶机（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提
供;PICO 21离心机，Thermo公司提供。

2 方法
2.1 检测方法
1）菌体浓度的检测
采用PMV法（packed mass volume）测定菌体生物量[9]。

2）样品处理方法
取发酵液1.0 mL，用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000
r/min离心10 min后取上清液进样。

3）HPLC检测色谱条件
色谱柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-四氢呋喃-三乙胺水（pH值为3.2，体积分数为0.2%），三者体积比为7∶1∶92），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为280 nm。

2.2 培养方法
1）斜面及平板培养
取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单孢子悬液涂布于平板培养基，28 ℃培养6～8 d。

2）种子培养
挖取约0.5 cm2斜面孢子接入装有30 mL种子培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养24 h。

3）发酵培养
种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养6 d放瓶。

4）50 L罐培养
采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0.5%接种于10 L种子培养基中，28 ℃培养48 h后以体积分数5%接种量转接于30 L发酵培养基中，发酵过程中通气比为1 m3/（m3·min-1），初始搅拌转速为350 r/min，发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20%（体积分数）。

发酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培养7 d放罐。

2.3 高产菌株选育
2.3.1 单孢子悬液的制备
取生长良好的斜面2支，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120
r/min振荡15 min打散菌体，过滤后制备成约106个/mL的单孢子悬液。

2.3.2 链霉素最低抑制浓度的确定
取50 μL单孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

2.3.3 复合诱变选育菌株
1）紫外诱变
取单孢子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30 cm，紫外功率为30 W）分别照射30，40，60，80，100 s，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

2）ARTP诱变
取单孢子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110 W，工作气流量为10 L/min，照射距离为2 mm），分别处理15，30，45，60，90 s后，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑選80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。

江苏海阔生物医药有限公司[5]采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9 g/L，且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7%;北大方正集团有限公司等[6]通过在发酵过程中每天补加0.1%～0.5%（质量分数）的硫酸铵，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可达到10 157 μg/mL。

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效[7]。

关亚鹏等[8]应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基，进一步提高万古霉素的发酵单位。

1 材料
1.1 菌种
研究所用菌种为东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 培养基
1）种子培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为20.0 g/L，蛋白胨为5.0 g/L，NaCl为5.0 g/L，K2HPO4为0.3 g/L，pH值为
7.0～7.2。

2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为30.0 g/L，工业淀粉为80.0 g/L，酵母粉为10.0 g/L，低温豆粉为15.0 g/L，NaCl 为1.0 g/L，KH2PO4为0.1 g/L，pH值为7.0～7.2。

1.3 主要原材料和仪器设备
1）原材料
葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。

2）儀器设备
发酵摇瓶机（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提
供;PICO 21离心机，Thermo公司提供。

2 方法
2.1 检测方法
1）菌体浓度的检测
采用PMV法（packed mass volume）测定菌体生物量[9]。

2）样品处理方法
取发酵液1.0 mL，用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000
r/min离心10 min后取上清液进样。

3）HPLC检测色谱条件
色谱柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-四氢呋喃-三乙胺水（pH值为3.2，体积分数为0.2%），三者体积比为7∶1∶92），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为280 nm。

2.2 培养方法
1）斜面及平板培养
取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单孢子悬液涂布于平板培养基，28 ℃培养6～8 d。

2）种子培养
挖取约0.5 cm2斜面孢子接入装有30 mL种子培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养24 h。

3）发酵培养
种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养6 d放瓶。

4）50 L罐培养
采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0.5%接种于10 L种子培养基中，28 ℃培养48 h后以体积分数5%接种量转接于30 L发酵培养基中，发酵过程中通气比为1 m3/（m3·min-1），初始搅拌转速为350 r/min，发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20%（体积分数）。

发酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培养7 d放罐。

2.3 高产菌株选育
2.3.1 单孢子悬液的制备
取生长良好的斜面2支，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120
r/min振荡15 min打散菌体，过滤后制备成约106个/mL的单孢子悬液。

2.3.2 链霉素最低抑制浓度的确定
取50 μL单孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

2.3.3 复合诱变选育菌株
1）紫外诱变
取单孢子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30 cm，紫外功率为30 W）分别照射30，40，60，80，100 s，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

2）ARTP诱变
取单孢子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110 W，工作气流量为10 L/min，照射距离为2 mm），分别处理15，30，45，60，90 s后，稀释涂布于平板培养基中，
28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。

江苏海阔生物医药有限公司[5]采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9 g/L，且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7%;北大方正集团有限公司等[6]通过在发酵过程中每天补加0.1%～0.5%（质量分数）的硫酸铵，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可达到10 157 μg/mL。

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效[7]。

关亚鹏等[8]应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基，进一步提高万古霉素的发酵单位。

1 材料
1.1 菌种
研究所用菌种为东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 培养基
1）种子培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为20.0 g/L，蛋白胨为5.0 g/L，NaCl为5.0 g/L，K2HPO4为0.3 g/L，pH值为
7.0～7.2。

2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为30.0 g/L，工业淀粉为80.0 g/L，酵母粉为10.0 g/L，低温豆粉为15.0 g/L，NaCl 为1.0 g/L，KH2PO4为0.1 g/L，pH值为7.0～7.2。

1.3 主要原材料和仪器设备
1）原材料
葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。

2）仪器设备
发酵摇瓶机（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提
供;PICO 21离心机，Thermo公司提供。

2 方法
2.1 检测方法
1）菌体浓度的检测
采用PMV法（packed mass volume）测定菌体生物量[9]。

2）样品处理方法
取发酵液1.0 mL，用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000
r/min离心10 min后取上清液进样。

3）HPLC检测色谱条件
色谱柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-四氢呋喃-三乙胺水（pH值为3.2，体积分数为0.2%），三者体积比为7∶1∶92），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为280 nm。

2.2 培养方法
1）斜面及平板培养
取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单孢子悬液涂布于平板培养基，28 ℃培养6～8 d。

2）种子培养
挖取约0.5 cm2斜面孢子接入装有30 mL种子培养基的三角瓶中，搖床转速为220 r/min，28 ℃培养24 h。

3）发酵培养
种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养6 d放瓶。

4）50 L罐培养
采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0.5%接种于10 L种子培养基中，28 ℃培养48 h后以体积分数5%接种量转接于30 L发酵培养基中，发酵过程中通气比为1 m3/（m3·min-1），初始搅拌转速为350 r/min，发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20%（体积分数）。

发酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培养7 d放罐。

2.3 高产菌株选育
2.3.1 单孢子悬液的制备
取生长良好的斜面2支，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120
r/min振荡15 min打散菌体，过滤后制备成约106个/mL的单孢子悬液。

2.3.2 链霉素最低抑制浓度的确定
取50 μL单孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

2.3.3 复合诱变选育菌株
1）紫外诱变
取单孢子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30 cm，紫外功率为30 W）分别照射30，40，60，80，100 s，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

2）ARTP诱变
取单孢子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110 W，工作气流量为10 L/min，照射距离为2 mm），分别处理15，30，45，60，90 s后，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。

江苏海阔生物医药有限公司[5]采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9 g/L，且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7%;北大方正集团有限公司等[6]通过在发酵过程中每天补加0.1%～0.5%（质量分数）的硫酸铵，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可达到10 157 μg/mL。

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效[7]。

关亚鹏等[8]应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基，进一步提高万古霉素的发酵单位。

1 材料
1.1 菌种
研究所用菌种为东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 培养基
1）种子培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为20.0 g/L，蛋白胨为5.0 g/L，NaCl为5.0 g/L，K2HPO4为0.3 g/L，pH值为
7.0～7.2。

2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为30.0 g/L，工业淀粉为80.0 g/L，酵母粉为10.0 g/L，低温豆粉为15.0 g/L，NaCl 为1.0 g/L，KH2PO4为0.1 g/L，pH值为7.0～7.2。

1.3 主要原材料和仪器设备
1）原材料
葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。

发酵摇瓶机（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提
供;PICO 21离心机，Thermo公司提供。

2 方法
2.1 检测方法
1）菌体浓度的检测
采用PMV法（packed mass volume）测定菌体生物量[9]。

2）样品处理方法
取发酵液1.0 mL，用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000
r/min离心10 min后取上清液进样。

3）HPLC检测色谱条件
色譜柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-四氢呋喃-三乙胺水（pH值为3.2，体积分数为0.2%），三者体积比为7∶1∶92），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为280 nm。

2.2 培养方法
1）斜面及平板培养
取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单孢子悬液涂布于平板培养基，28 ℃培养6～8 d。

2）种子培养
挖取约0.5 cm2斜面孢子接入装有30 mL种子培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养24 h。

3）发酵培养
种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养6 d放瓶。

采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0.5%接种于10 L种子培养基中，28 ℃培养48 h后以体积分数5%接种量转接于30 L发酵培养基中，发酵过程中通气比为1 m3/（m3·min-1），初始搅拌转速为350 r/min，发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20%（体积分数）。

发酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培养7 d放罐。

2.3 高产菌株选育
2.3.1 单孢子悬液的制备
取生长良好的斜面2支，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120
r/min振荡15 min打散菌体，过滤后制备成约106个/mL的单孢子悬液。

2.3.2 链霉素最低抑制浓度的确定
取50 μL单孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

2.3.3 复合诱变选育菌株
1）紫外诱变
取单孢子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30 cm，紫外功率为30 W）分别照射30，40，60，80，100 s，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

2）ARTP诱变
取单孢子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110 W，工作气流量为10 L/min，照射距离为2 mm），分别处理15，30，45，60，90 s后，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

中国生产万古霉素的厂家（如浙江新昌制药、浙江海正药业、重庆大新药业及华北制药等）都在致力于提高发酵单位的研究。

江苏海阔生物医药有限公司[5]采用核糖体诱变选育方法获得的万古霉素生产菌株发酵液产量（质量浓度，下同）高达8.9 g/L，且菌株传代稳定，连续传代5次后万古霉素产量稳定性高达92.7%;北大方正集团有限公司等[6]通过在发酵过程中每天补加0.1%～0.5%（质量分数）的硫酸铵，万古霉素含量（质量浓度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可达到10 157 μg/mL。

常压室温等离子体（atmospheric and room temperature
plasma，ARTP）具有操作简单、突变率高、获得的突变株稳定性好，已在诸多领域应用并取得成效[7]。

关亚鹏等[8]应用ARTP诱变选育非达霉素高产菌株，摇瓶发酵能力比出发菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列诱变筛选措施对万古霉素产生的菌株东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02进行选育，旨在获得万古霉素高产菌株，并且通过优化发酵培养基，进一步提高万古霉素的发酵单位。

1 材料
1.1 菌种
研究所用菌种为东方拟无枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由华北制药华胜有限公司提供。

1.2 培养基
1）种子培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为20.0 g/L，蛋白胨为5.0 g/L，NaCl为5.0 g/L，K2HPO4为0.3 g/L，pH值为
7.0～7.2。

2）发酵培养基（除pH值外，其余物质含量均为质量浓度）
葡萄糖为30.0 g/L，工业淀粉为80.0 g/L，酵母粉为10.0 g/L，低温豆粉为15.0 g/L，NaCl 为1.0 g/L，KH2PO4为0.1 g/L，pH值为7.0～7.2。

1.3 主要原材料和仪器设备
1）原材料
葡萄糖，河北金锋淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家庄赛特工贸有限公司提供;工业淀粉，河北兴柏药业集团有限公司提供;酵母粉，浙江东成生物科技股份有限公司提供;低温豆粉，栾城县通大工贸有限公司提供;无机盐，均由天津市永大化学试剂有限公司提供。

2）仪器设备
发酵摇瓶机（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等离子诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色谱仪，岛津公司提供;PICO 21离心机，Thermo公司提供。

2 方法
2.1 检测方法
1）菌体浓度的检测
采用PMV法（packed mass volume）测定菌体生物量[9]。

2）样品处理方法
取发酵液1.0 mL，用体积分数2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000
r/min离心10 min后取上清液进样。

3）HPLC检测色谱条件
色谱柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-四氢呋喃-三乙胺水（pH值为3.2，体积分数为0.2%），三者体积比为7∶1∶92），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为280 nm。

2.2 培养方法
1）斜面及平板培养
取冷冻保存的甘油管接入斜面培养基或诱变处理的单孢子悬液涂布于平板培养基，28 ℃培养6～8 d。

2）种子培养
挖取约0.5 cm2斜面孢子接入装有30 mL种子培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养24 h。

3）发酵培养
种子培养液以体积分数5%的接种量接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中，摇床转速为220 r/min，28 ℃培养6 d放瓶。

4）50 L罐培养
采用两级发酵，母瓶种子液以体积分数0.5%接种于10 L种子培养基中，28 ℃培养48 h后以体积分数5%接种量转接于30 L发酵培养基中，发酵过程中通气比为1 m3/（m3·min-1），
初始搅拌转速为350 r/min，发酵过程中通过控制搅拌调节溶氧量，保证最低溶氧量不低于20%（体积分数）。

发酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培养7 d放罐。

2.3 高产菌株选育
2.3.1 单孢子悬液的制备
取生長良好的斜面2支，加入无菌水洗下孢子，转入装有玻璃珠的三角瓶中，摇床120
r/min振荡15 min打散菌体，过滤后制备成约106个/mL的单孢子悬液。

2.3.2 链霉素最低抑制浓度的确定
取50 μL单孢子悬液分别涂布于含有不同浓度链霉素的平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

2.3.3 复合诱变选育菌株
1）紫外诱变
取单孢子悬液置无菌平皿中，于紫外诱变箱（照射距离为30 cm，紫外功率为30 W）分别照射30，40，60，80，100 s，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。

2）ARTP诱变
取单孢子悬液涂于金属载片上，于ARTP诱变箱（电源功率为110 W，工作气流量为10 L/min，照射距离为2 mm），分别处理15，30，45，60，90 s后，稀释涂布于平板培养基中，28 ℃培养6～8 d。

根据菌落大小和形态特征，每个诱变条件下挑选80～100个单菌落按照2.2项的方法进行筛选，计算突变率。