免疫原和抗血清的制备PPT课件

（六）亲和层析
亲和层析是利用生物大分子的生物学特 异性，即生物分子间所具有的专一性亲 和力而设计的层析技术。例如抗原和抗 体、酶和酶抑制剂、酶蛋白和辅酶、 DNA 和 RNA 、激素和受体等 之间有特 殊的亲和力,在一定的条件下,二者能紧 密地结合成复合物。如果将复合物的已 知一 方固定在固相载体上,则可从溶液 中专一性地分离和提纯另一方。
上清液中含有 可溶性抗原
上清 1万—2万转/分，20到30分钟
沉淀
2. 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备
制备抗原的细胞包括正常细胞、传代细胞或 病理细胞 ( 如肿瘤细胞 )。
(1) 反复冻融法；(2) 超声破碎法；(3) 自溶 法；(4) 酶处理法；(5) 表面活性剂处理法。
( 二 ) 超速离心分离法
绵羊红细胞、细菌、毒素、寄生虫和真 菌抗原的制备
二、可溶性抗原的制备和纯化
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、 酶、补体和核酸等都是良好的可溶性抗 原。
（一） 组织和细胞粗抗原的制备
1. 组织细胞抗原的制备所用组织必须是新鲜
的或低温保存的。
高速组织捣碎机
器官或者组织
处理
粉碎 研磨法
离心3000r/min，10分钟
一、佐剂的种类
1. 具有免疫原性的佐剂 如卡介苗、枯草 分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、 革兰阴性杆菌内毒素 ( 脂多糖 ) 和细胞 因子等。
2. 非免疫原性佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、 磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、 藻酸钙、多聚核昔酸和胞壁肽等。
1. 福氏佐剂 (Freund adjuvant,FA) 是目 前动物免疫中最常应用的佐剂 , 可分为 福氏不完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 ) 和福氏完全佐剂 ( 石蜡油 + 羊毛脂 + 卡介苗 ) 两种 。
三、动物采血法
动物免疫 3~5 次后, 如抗血清抗体效价经测 定合格后即可放血。如血清效价不理想可追 加免疫 1~2 次后再行放血。应选择在末次免 疫后 5~7 天及时采血, 否则抗体效价会下降。
目前较常用的采血方法有以下三种。
1. 颈动脉放血法 这是最常用的方法。 2. 心脏采血法 一只家兔一次可取血
抗原和抗体是免疫学检测的两个重 要因素 , 也是整个免疫反应的基 本条件
第一节 免疫原的制备
免疫原是诱导机体产生抗体和致敏淋巴 细胞,并能在体内外与抗体或致敏淋巴细 胞发生特 异性反应的物质。
在制备抗体的过程中,合格的免疫原是制 备高质量抗体的重要保障。
一、颗粒性抗原的制备
颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原 以及各种细菌抗原和寄生虫体抗原。
(四) 凝胶过滤
凝胶过滤又名分子筛层析，凝胶是具有 三维空间多孔网状结构的物质，经过处 理平衡后，装入层析柱内成为分子筛的 支撑物。
(五) 离子交换层析
离子交换层析是利用一些带电离子基团 的凝胶或纤维素，吸附交换带有相反电 荷的蛋白质抗原。
离子交换层析技术中常用的离子 交换剂有四种: ①具有离子交换 基团的纤维素 , 常称离子交换 纤维素; ②具有离子交换基团的 交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰 胺; ③被覆以离子化物质的细粉; ④凝胶合成的高度交联树脂。
2. 细胞因子佐剂 细胞因子佐剂与抗原 合用 , 可 以更有效地激发机体的免疫 功能 , 增强免疫反应。
二、佐剂的免疫生物学作用
1. 增强免疫原性 使弱免疫原性物质变成 持久或强的免疫原。
2. 增加抗体的滴度 可提高机体初次和再 次免疫应答的抗体滴度。
3. 引起或增强迟发型超敏反应 由于佐剂 作用引起过强的免疫应答而导致的病理 生理反应。
4. 酶裂解法
(八) 纯化抗原的鉴定
纯化抗原的鉴定一般包括含量鉴定、理 化性质鉴定、纯度鉴定和免疫活性鉴定 等。
三、半抗原性免疫原的制备
只有把半抗原与蛋白质载体或与高分子 聚合物结合后,才能刺激机体产生特异性 抗体或致敏淋巴细胞。
（一）载体的选择 载体有蛋白质、 多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒 等。
20~30ml。 3. 静脉多次采血法 家兔可取耳中心静脉 ,
山羊和绵羊可取颈静脉采血。
第四节 抗血清的鉴定和保存
在收获血清前, 应用标准抗原进行鉴定及测 定其效价, 若达到预期目的效价, 应及时采 血,否则抗体效价将会下降。
一、抗血清的鉴定
(一) 双向免疫扩散法对抗体特异性的鉴定 (二) 双向免疲扩散法对抗体效价的鉴定 (三) 抗体的纯度鉴定
三、佐剂增强免疫应答的机制
1. 改变抗原物理性状 , 使抗原在体内滞留或缓 慢释放 , 延长抗原与免疫细胞作用的时间，从 而增强抗原免疫原性。
2. 抗原在佐剂的辅佐作用下 , 更易被巨噬细胞 吞噬和有效的加工处理与呈递。
3. 剌激单核 / 巨噬细胞活化 , 释放细胞因子调 节和增强淋巴细胞的应答能力。
( 二 ) 半抗原 -载体连接方法
半抗原与载体连接必须掌握三个基本条件 : ① 带游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半 抗原；②带有羟基、 酮基和醛基的半抗原,不 能直接与载体连接, 需要用化学方法在半抗原 上引进羧基后才能与载体连接；③芳香族半抗 原由于环上带有羧基 , 它邻位上的氢很活泼 , 极易取代。
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
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结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
(七) 免疫球蛋白片段的制备
1. 温和条件离析亚单位：可用两种方法将其 断开制备片段。第一种方法为改变 pH；第二 种方法是利用强变性剂将亚单位分开。
2. 二硫键的解离：二硫键是连接免疫球蛋白 肽链的共价键 , 解离二硫键后可将重链和轻 链分开解离的方法多采用还原法或氧化法。
3. 溴化氰裂解法：溴化氰与蛋白质中的甲硫 氨酸侧链硫醚基起反应后,生成溴化亚氨内酯, 再与水反应, 将肽链断裂。
③抗血清的要求 : 抗血清可分为 R(rabbit) 型与H (horse) 型。R 型抗血清能和很小量的抗原结合, 形 成可见的沉淀线 , 具有 较宽的抗原抗体比例范围 ； H 型抗血清用于沉淀反应 , 较难掌握 , 因而极少应 用。
④抗原的选择: 对蛋白质抗原 , 大部分动物皆适 合, 较常用的是家兔与山羊；
4.抗体的产生阶段 颗粒抗原注射以后,追踪血液 内抗体产生的过程,一般可以观察到 4 个阶段。① 静止期 : 约 2 天 , 此时血液中尚无抗体, 仅有 抗原成分; ②指数期: 约 4 天左右,此时被免疫动 物体内抗体水平迅速上升 , 先出现IgM,后出现 IgG,其抗体含量约在 6~7 天达高峰; ③稳定期: 约 2~4 周,在这期间血液中抗体浓度保持在一个相 对稳定的水平; ④下降期: 约是几个月至1到2年, 在这期间抗体浓度缓慢而平稳地下降。
超速离心分离法最常用于分离亚细胞成 分及大分子蛋白质
用超速离心或梯度密度离心分离和纯化 抗原只是一种根据抗原的比重特点分离 的方法 , 除 个别成分外 , 极难将某一 抗原成分分离出来。
（三）选择性沉淀法
1.核酸去除法：用沉淀剂或者核酸酶 2.盐析沉淀法：该方法是最经典的蛋白
质纯化分离技术。用于抗原的粗筛、提 取丙种球蛋白和抗原的浓缩。 有机溶剂沉淀法 水溶性非离子型聚合物沉淀法
第三章免疫原和抗血清的制备抗原和抗体是免疫学检测的两个重要因素也是整个免疫反应的基本条件iso组织成立于1946年10月总部设于瑞士日内瓦有九十四个会员国组成137个国家或地区采用该组织标准该组织设立之目的在于推动国际性标准以作为其会员国各项制度推行之依据统计到去年底共制定了13700多份标准
第三章 免疫原和抗血清的制备
⑤甾体激素及酶 : 简体激素免疫多用家兔 , 酶类 免疫多用豚鼠。
二、免疫方法和途径
1.免疫原的注射剂量和时间 应考虑抗原性强弱、 分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
2.免疫途径 免疫途径通常有静脉、腹腔、肌肉、 皮内、皮下、淋巴结和足掌等。
3.免疫方案 根据设计的目的要求、抗原性质和佐 剂的种类等来制定免疫方案。
4. 剌激淋巴细胞增生分化 , 从而增强和扩大免 疫应答能力。
第三节 抗血清的制备
制备抗血清的目的主要是为获取高质量 抗体用于检测抗原或抗体 , 同时也为诊 断性实验提 供具特异性的诊断试剂。
一、免疫动物的选择
选择时应考虑以下几个因素 : ①抗原与免疫动物种 属差异越远越好 ；
②动物个体的选择 : 必须适龄、健康 ( 以雄性为 佳 ) 及无感染的正常动物 , 体重合符要求。不同动 物种类对同一免疫原有不同的免疫应答表现 , 因此 对不同性质的免疫原 , 所选用的动物有所不同
抗原结合到载体上的数目与免疫原性有关。 一般认为应连接 20 个以上的半抗原,才能有 效地产生抗体。因此当结合完成后,应测量半 抗原与载体的比例。
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂 (immunoadjuvant) 是指那些与 抗原一起或先于抗原注入机体后可增强 机体对该抗原的免疫应答能力或改变免 疫应答类型的辅助物质。