逆转录病毒试用装操作手册

汉恒逆转录病毒操作手册
一、逆转录病毒的试用装分装与储存
1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。

如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。

2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。

3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，108IU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度107IU/ml滴度逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。

二、逆转录病毒试用装实验策略与关键知识点
1.逆转录病毒感染策略：逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。

逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。

而不是直接大量感染。

注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。

2.逆转录病毒感染关键知识点
1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。

逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。

MOI一般以3：10：30：100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI 可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。

3)助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。

4）MOI对应病毒体积的换算（非常重要）
感染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

比如第一天传代104细胞到96孔板一个孔，第二天长到2×104细胞，按照MOI=20计算，需加入病毒总量为2×104×20=4×105，按照逆转录病毒1×108IU/ml的滴度，则加入的病毒体积数为
(4×105)/(1×108IU/ml)=4×10-3 ml=4μl。

三、逆转录病毒感染细胞步骤：（1/2小体积感染法）
1.感染前准备
1）按实验需要将细胞铺96孔板，37℃培养过夜。

细胞数以第2天密度约40%～60%间为宜。

2）从冰箱取出逆转录病毒并在冰上缓慢融化，待完全融化后开始病毒感染实验。

2. 目的细胞的感染(1/2体积4小时感染法）
1）吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，并往新鲜培养基里加入终浓度5～8μg/ml的polybrene(部分polybrene不耐受细胞除外），再根据选定的MOI值，换算对应的病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀。

1/2体积4小时病毒感染体积表
培养皿类型表面积/cm21倍细胞培养基体积1/2培养基体积
96-well 0.3cm2100ul 50ul
24-well 2cm2500ul 250ul
2）针对贴壁细胞，细胞中加入病毒液后直接置于37℃培养箱感染4小时。

若目的细胞是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法进一步促进病毒对细胞的感染性吸附，即将适量的病毒液加入细胞培养板后，封好口，放入平角离心机后，低速（300g）离心1h，然后放入37℃培养箱中继续积感染3小时。

3）37℃培养箱中感染完毕后，取出细胞，直接往含病毒的培养基中加入另外1/2体积新鲜培养基（含终浓度5～8μg/ml的polybrene，部分polybrene不耐受细胞除外）。

4）感染后第二天（约12-16小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液（不含polybrene），继续37℃培养。

5）感染72小时后，荧光显微镜检测GFP等荧光表达效率，确定最适MOI。

6）稳转株的初筛选：如病毒载体携带puromycin抗性，感染72小时后置换含适当浓度的puromycin（1～3μg/ml，）的新鲜完全培养液，同时准备一组普通目的细胞（简称Blank组，其细胞数量、密度和病毒感染组细胞一致），加入等终浓度的puromycin。

每2-3天换含puromycin的完全培养液一次，直到Blank组细胞被puromycin杀光。

7）稳转株的二次筛选与培养放大：将puromycin终浓度减半（简称：1/2 puro培养基）培养存活的病毒感染组的细胞（包括目的基因和对照病毒组），并在细胞长密到80%左右进行细胞传代，传代后的细胞为P2代稳转株，P2代-P4代继续用1/2 puro培养基培养细胞，大量扩增细胞至4代，并大量冻存P4代的稳转细胞株，以备后续实验。

注：为保证实验结果的稳定性及可重复性，稳转细胞株的后续功能检测都用相同代数的稳转细胞株，尽量选择P4代冻存后3代内，即P7代以内的稳转株进行功能实验。

部分细胞Puromycin参考值：
Cell line Species Puromycin 筛选浓度(µg/ml)
293系列Human 2
HeLa Human 2
B16 Mouse 1-3
H9C2 Rat 1
MCF-7 Human 1-3
MDA-MB-×××Human 1-3
HepG2 Human 2
HT1080 Human 1
A549 Human 2
H1299 Human 2
Human embroyonic
Human 1
stem cells（Human
ESCs）
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