黄连上清片微生物限度检查方法适用性试验报告

药品微生物限度检查方法适用性实验报告
生产单位：********有限公司
检品名称：黄连上清片
检品编号：201600479
检品批号：20160303
试验项目：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法和控制菌检查方法的适用性实验。

试验依据：中国药典2015年版四部1105,1106
试验方法：中国药典2015年版四部1105,1106
试验要求：1、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验中，各试验菌试验组菌落减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的
比值应在0.5~2范围内。

2、各控制菌检查方法适用性试验中，试验组应检出试验菌。

试验结果：符合规定
试验结论：根据方法适用性试验结果，本品微生物限度检查法为：
需氧菌总数采用稀释-平皿倾注法（1：50供试液1ml/皿）；
霉菌和酵母菌总数计数方法采用平皿倾注法；
大肠埃希菌检查法：取1:10供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中。

沙门菌检查法：取10g，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基中用匀浆仪1档1分混匀。

耐胆盐革兰阴性菌检查法：取1:10供试液1ml加入10ml肠道增菌液体培养基中。

黄连上清片微生物限度检查方法适用性试验
检品名称：黄连上清片
检品编号：201600479
检品批号：20160303
生产单位：********有限公司
1、方法：
1.1检查方法：中国药典2015年版四部1105,1106
1.2试验方法：中国药典2015年版四部1105,1106
2、计数方法适用性试验：
2.1菌种：金黄色葡萄球菌〈CMCC(B)26 003〉
铜绿假单胞菌〈CMCC(B)10 104〉
枯草芽孢杆菌〈CMCC(B)63 501〉
白色念珠菌〈CMCC(B)98 001〉
黑曲霉〈CMCC(B)98 003〉
2.2菌液制备：
2.2.1取经35℃培养22小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养基培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，做活菌计数用。

2.2.2取经25℃培养24小时的白色念珠菌沙门氏菌葡萄糖液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，做活菌计数用。

2.2.3接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，培养5天，加入适量含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液脱孢子，吸出孢子悬液，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

2.3供试液的制备：取10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，充分混匀，制成1:10供试液。

取10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，充分混匀，再加加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至400ml混匀，即为1：50供试液。

2.4需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法回收试验
2.4.1实验组：取1:10供试液10ml加入0.1ml试验菌液，混匀，使每1ml供试液中含量不大于100cfu。

取该溶液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养
基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定其菌数。

结果见表1~表3。

2.4.2菌液对照组：取PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液按试验组操作加入试验菌液，取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。

测定其菌数。

结果见表1~表3。

2.4.3供试品对照组：取1:10供试液10ml，以PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作后，各取1ml加入4个平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基。

测定供试品本底菌数。

结果见表1~表3。

2.5结果统计
表1 平皿倾注法试验结果（第一次）
试验日期：2016.5.4
注：白色念珠菌、黑曲霉两组回收试验结果，使用培养基左列为胰酪大豆胨
琼脂培养基、右列沙氏葡萄糖琼脂培养基。

表2平皿倾注法试验结果（第二次）
试验日期：2016.5.9
注：白色念珠菌、黑曲霉两组回收试验结果，使用培养基左列为胰酪大豆胨琼脂培养基、右列沙氏葡萄糖琼脂培养基。

表3 平皿倾注法试验结果（第三次）
试验日期：2016.5.12
注：白色念珠菌、黑曲霉两组回收试验结果，使用培养基左列为胰酪大豆胨琼脂
培养基、右列沙氏葡萄糖琼脂培养基。

结论：由表1~表3结果可知，除铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌外，各试验菌试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5~2范围内，说明本品霉菌和酵母菌总数计数方法可采用平皿倾注法，需氧菌总数计数方法还需进一步试验。

现增加稀释液体积对铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌的计数方法适用性进一步试验，试验方法和结果如下：
实验组：取1:50供试液10ml，加入0.1ml试验菌液，混匀，使每1ml供试液中含量不大于100cfu。

取该溶液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定其菌数。

结果见表4~表6。

菌液对照组：方法同平皿倾注法。

2.4.3供试品对照组：取1:50供试液10ml，以PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作后，各取1ml加入2个平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基。

测定供试品本底菌数。

结果见表4~表6。

表4平皿倾注法试验结果（第一次）
试验日期：2016.5.9
表5平皿倾注法试验结果（第二次）
试验日期：2016.5.12
表6平皿倾注法试验结果（第三次）
试验日期：2016.5.16
结论：由表4~表6结果可知，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5~2范围内，说明本品需氧菌总数计数方法可采用此方法。

3、控制菌检查方法适用性试验
3.1 菌种：大肠埃希菌[CMCC (B) 44 102]
铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10 104]
乙型副伤寒沙门菌[CMCC (B) 50 094]
3.2 菌液制备：接种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养22小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。

3.3 供试品溶液的制备：取10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，充分混匀，制成1:10供试液。

3.4 大肠埃希菌检查方法适用性试验
3.4.1 试验组：取1:10溶液10ml及1ml含10~100cfu的大肠埃希菌菌悬液，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，依照大肠埃希菌的检查方法进行检查。

3.4.2 结果：见表7~表9
表7 大肠埃希菌检查方法适用性试验（第一次）
表8 大肠埃希菌检查方法适用性试验（批号：第二次）
表9 大肠埃希菌检查方法适用性试验（第三次）
结论：由以上结果可知，试验组检出试验菌，故该供试品大肠埃希菌的检
查可采用此检查法。

3.5 沙门菌检查方法的验证
3.5.1 试验组：取10g加入200mlTSB培养基中用匀浆仪1档1分混匀，并在培养基中加入不大于100cfu的沙门菌菌悬液，依照沙门菌的检查法进行检查。

3.5.2 结果：见表10，11，12
表10 沙门菌检查方法的验证（第一次）
表11 沙门菌检查方法的验证（第二次）
表12 沙门菌检查方法的验证（第三次）
结论：由表13~表15结果可知，试验组检出试验菌，故本品沙门菌的检查方法可采用此检查法。

3.6 耐胆盐革兰阴性菌检查方法的验证
3.6.1 试验组：取1:10供试液1ml及不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液，加入10ml肠道增菌液体培养基中，依照耐胆盐革兰阴性菌的检查法进行检查；取1:10供试液1ml及不大于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液，加入10ml肠道增菌液体培养基中，依照依照耐胆盐革兰阴性菌的检查法进行检查；
3.6.2 结果：见表13,14,15
表13 耐胆盐革兰阴性菌的检查方法的验证（第一次）
表14 耐胆盐革兰阴性菌的检查方法的验证（第二次）
表15 耐胆盐革兰阴性菌的检查方法的验证（第三次）
结论：由以上结果可知，试验组检出试验菌，故本该供试品耐胆盐革兰阴性菌的检查可采用该检查法。

试验结论：根据方法适用性试验结果，本品微生物限度检查法为：
需氧菌总数采用稀释-平皿倾注法（1：50供试液1ml/皿）；
霉菌和酵母菌总数计数方法采用平皿倾注法；
大肠埃希菌检查法：取1:10供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中。

沙门菌检查法：取10g，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基中用匀浆仪1档1分混匀。

耐胆盐革兰阴性菌检查法：取1:10供试液1ml加入10ml肠道增菌液体培养基中。