程序性细胞死亡与细胞衰老

◆DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带。
◆TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法。
◆彗星电泳法（comet assay）：将细胞裂解处理，电 泳并用荧光染料染色，凋亡细胞DNA降解片断在电 场中泳动速度快，使细胞核呈彗星式图案。
◆流式细胞分析：凋亡细胞DNA断裂和丢失，呈亚二
倍体状态，用碘化丙腚染色使DNA产生激发荧光。
起始Caspase和执行Caspase组成细胞内凋亡信号的联级分子网 络，凋亡程序一旦启动，网络顶端起始Caspase首先活化，切 割下游Caspase酶原，使得凋亡信号在短时间内迅速放大并传 递到整个细胞，产生凋亡效应。
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死亡受体起始的外源途径
▲凋亡信号通路：死亡配体主要是肿瘤坏死因子（TNF)家族成 员，死亡配体的生物学功能是通过与细胞表面的受体结合来实 现的，TNF-R1和Fas是死亡受体家族的代表成员，它们的胞质 部分均含有死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通路中的 信号分子。
植物细胞与酵母细胞的程序性死亡
– 植物细胞的程序性死亡：木质部管状细胞的成熟过程， 植物细胞在受到真菌或细菌感染后会发生主动快速死 亡。死亡细胞的残余被细胞壁固定在原位，被液泡中 水解酶消化。
– 酵母细胞的程序性死亡：与动物程序性死亡类似。
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细胞凋亡(Apoptosis)
●细胞凋亡的概念和特征
▲寿命短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体系降解； ▲寿命较长的细胞结构及蛋白质通过细胞自噬途径。
◆细胞自噬参与了细胞死亡的过程，是与细胞凋亡不同的另一 种程序性死亡方式。线虫幼虫在营养不良时会通过细胞自噬 降解自身的部分细胞维持个体存活。细胞自噬不需要吞噬细 胞就能自我销毁，可能是细胞凋亡的补充途径。
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细胞凋亡的概念和特征
●细胞凋亡生物学意义：强调这种细胞的死亡方式是自然的生 理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。
●动物细胞凋亡的过程，在形态学上分为三个阶段：
◆凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失， 但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离， 内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结 构等形态，沿着核膜分布；
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细胞坏死（necrosis）
◆ 细胞坏死是细胞区别于细胞凋亡的另一种典型的细胞死亡 方式，当细胞受到意外损伤或严重的病理性刺激的情况下细胞 发生坏死；细胞内ATP下降到无法维持细胞存活的水平，坏死 细胞的细胞质出现空泡，细胞质膜破损，细胞内含物释放到胞 外，引起炎症。细胞坏死过程染色体不发生凝集，不产生有规 律的200bp的DNA片段。
而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限
●细胞衰老过程形态结构方面的变化
◆细胞核的变化：体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增 大，细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化。
◆内质网的变化：衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的 总量减少了。
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细胞凋亡的分子机制
●诱导细胞凋亡的因子
●Caspase家族与凋亡
◆ Caspase ◆ Caspase依赖性的细胞凋亡
▲死亡受体起始的外源途径
▲线粒体起始的内源途径
◆ Caspase非依赖性的细胞凋亡 ◆ 生死抉择：细胞凋亡的调控
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诱导细胞凋亡的因子
◆物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较 温和的温度刺激（如热激，冷激）等。
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生死抉择：细胞凋亡的调控
Caspase抑制因子：直接与Caspase活性分子结 合，阻抑其对底物的切割作用，包括c-IAP家 族7个成员，c-FLIP，BAR和ARC；所有IAP家族 成员都具有70个氨基酸残基组成的BIR结构域， 对抑制凋亡是必需的。
IAP家族成员的抗凋亡作用也能被特异的抑制
●细胞凋亡的生理意义：对于动物个体的正常发
育，自稳态的维持，免疫耐受的形成，肿瘤监控 等多种生理及病理过程具有重要意义。
– 蝌蚪尾的消失，发育过程中手和足的成形过程； – 脊椎动物的神经系统的发育；
– 凋亡不足导致肿瘤在内的多种疾病，调亡过度导致机体 免疫功能的丧失。
●细胞凋亡的检测方法
●细胞凋亡的分子机制
◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，钙离子 载体，维生素K3，视黄酸，细胞毒素，DNA和蛋白 质合成的抑制剂，正常生理因子（激素，细胞生长 因子等）失调以及肿瘤坏死因子（TNF）处理等。
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Caspase
◆Caspase：是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶， 活性位点均包含半胱氨酸残基，裂解靶蛋白位点是天冬氨
●胁迫诱导的早熟性衰老：代谢过程中产生的活性氧基团或分 子（ROS--- O2-，OH-，H2O2），引发的氧化性损伤的积累， 最终导致衰老。
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细胞衰老的分子机制
●复制衰老的机制：端粒酶的发现证实端粒长度与衰老有着密 切的关系，端粒被认为是细胞的“分子时钟”。pRb蛋白与 转录因子E2F家族结合阻抑其活性，E2F负责转录G1/S期转换 以及DNA复制过程中的基因，E2F被pRb封闭；CDK磷酸化pRb 细胞可进入S期；如果CDK活化被抑制，细胞停留在G1期，阻 断细胞周期正常运行，引发复制型细胞衰老。CDK抑制因子 （p16和p21）引起衰老。
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线粒体起始的内源途径
◆细胞受到内部或外部的凋亡信号刺激时，线粒体外膜的通透性会发生 改变，向细胞质基质中释放出凋亡相关因子，引发细胞凋亡。哺乳动 物细胞接受凋亡信号刺激，CytC从线粒体释放到细胞质中，与另一个 凋亡因子Apaf-1结合，诱导细胞凋亡发生。
◆线粒体外膜通透性改变主要受到Bcl-2蛋白家族的调控，是Ced-9在哺乳 类中的同源物，含有一个或多个BH结构域，定位在线粒体外膜上，或 接受信号后转移到线粒体外膜上。
◆细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式，推测的 原因是DNA损伤的积累导致DNA修复蛋白：多聚腺苷二磷酸-核 糖聚合酶{PARP}被活化，使得细胞核内NAP+大量减少，导致糖 酵解被抑制，ATP水平下降。
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细胞自噬（autophagy）
◆正常的动物细胞为了维持细胞内环境的动态平衡，需要不断 地降解功能失常的或不需要的细胞结构，如各种蛋白质、细 胞器以及各种细胞组分：
NAIP(BIRC1) c-IAP1 (BIRC2) c-IAP2(BIRC3) XIAP(BIRC4) Survivin(BIRC5) Livin(BIRC7) ILP-2(BIRC8) c-FLIP(I-FLICE) ARC BAR
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抑制底物
Caspase-3,-7 Caspase-3,-7 Caspase-3,-7 Caspase-3,-7,-9 Caspase-3,-7 Caspase-3,-7,-9 Caspase-9 Caspase-8,-10 Caspase-2,-8 Caspase-8
◆哺乳动物细胞Caspase家族成员有15种。
◆细胞凋亡的分为激活期和执行期两个阶段。
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细胞凋亡分为两个阶段
激活期：前期细胞应答死亡信号，起始Caspase活化。凋亡信 号刺激→酶原分子在特异性的Asp位点被切割→形成两个大小 亚基的异二聚体→具有活性的Caspase；
执行期：后期执行Caspase活化，执行细胞死亡程序。起始 Caspase招募执行Caspase酶原分子后→进行切割→产生具有活 性的执行CaspΒιβλιοθήκη Baiduse→切割细胞内重要的结构和功能蛋白→细胞 凋亡。已知执行Caspase底物约280种。
因子解除，当凋亡程序启动后，有两种蛋白 Smac/DIABLO 和 Omi/HtrA2 与 CytC 一 起 从 线 粒 体 中 释 放 ， 两 种 蛋 白 含 有 IAP 结 合 基 序 ， 与 IAP结合并释放出被IAP封闭的Caspase。
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内源性Caspase抑制因子
名称
第十三章 程序性细胞死亡 与细胞衰老
●程序性细胞死亡 （programmmed cell death,PCD） ●细胞衰老 （cell ageing或cell senescence ）
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程序性细胞死亡
动物细胞程序性死亡
– 细胞凋亡（apoptosis） – 细胞坏死（necrosis） – 细胞自噬（autophagy）
◆线粒体的变化：细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大。
◆致密体的生成：衰老的动物细胞致密体积累，由溶酶体或线粒体转化而来。
◆膜系统的变化：衰老的细胞，其膜的流动性降低、韧性减小，衰老细胞间隙连接
减少。
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皮肌炎图片——皮肌炎的症状表现
皮肌炎是一种引起皮肤、肌肉 、心、肺、肾等多脏器严重损害 的，全身性疾病，而且不少患者 同时伴有恶性肿瘤。它的1症状表 现如下：
◆限制性内切酶G（Endo G）：属于Mg2+依赖性的核 酸酶家族，定位于线粒体，主要功能负责线粒体 DNA的修 复和复制。受到凋亡信号的刺激后 ， Endo G从线粒体释放出来进入细胞核，对DNA进 行切割。在Caspase未被激活的情况下，产生典型 的以核小体为单位的DNA片段。
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细胞衰老 (cellular aging或cell senescence)
●细胞衰老的概念及特征 ●细胞衰老的分子机制 ●细胞衰老与个体衰老和癌症的关系
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细胞衰老的概念及特征
●概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍
体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，
◆细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从胞质中转移 到线粒体外膜上，与膜上阴离子通道蛋白作用，使通道开放，线粒体 内凋亡因子（CytC）释放到细胞质基质中，引发细胞凋亡。
◆Bcl-2、线粒体与细胞凋亡
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Caspase非依赖性的细胞凋亡
◆凋亡诱导因子（AIF）：是能够诱导Caspase非依 赖性细胞凋亡的因子，位于线粒体外膜，凋亡过 程中，AIF从线粒体转移到细胞基质内，进而进入 细胞核，引起核内DNA凝集并断裂成50kp大小的 片段。
酸残基后的肽键，因此称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋
白水解酶（Cysteine aspartic acic specific protease），即 Caspase。负责选择性切割蛋白质，使靶蛋白活化或失活。
◆线虫(C. elegans)凋亡研究发现ced3，ced4基因促进细胞凋亡， ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳 类 同 源 物 是 白 介 素 -1β 转 换 酶 （ Interleukin-1β converting enzyme，ICE），被命名Caspase-1：
▲举例：配体与Fas结合→Fas聚合→Fas通过胞质区的死亡结构 域招募接头蛋白FADD和Caspases-8酶原→形成死亡诱导复合物 DISC→Caspases-8酶原在复合物中通过自身切割被激活→切割执 行者Caspases-3酶原→产生有活性的Caspases-3→导致细胞凋亡。 活化的Caspases-8酶还通过切割Bcl-2家族成员的Bid将凋亡信号 传递到线粒体，引发内源途径，信号进一步放大。
◆凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如 线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状 或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体；
◆凋亡小体逐渐为邻近的细胞或体内的吞噬细胞所吞噬，凋亡细胞的残
余物质被消化后重新利用。
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细胞凋亡的检测方法
◆形态学观测：染色法（台盼蓝）、透射和扫描电镜 观察。
1、早期皮肌炎患者，还往往伴 有全身不适症状，如-全身肌肉酸 痛，软弱无力，上楼梯时感觉两 腿费力；举手梳理头发时，举高 手臂很吃力；抬头转头缓慢而费 力。
不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数
细胞来源
人胚肺成纤 维细胞
中年人成 纤维细胞
可增殖
代数
40-60
20
老年人成 纤维细胞
2-4
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