基因克隆过程及注意事项

以猪APOA2基因为例
一．提取总RNA
TRIzol法提取RNA
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用
Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。

并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。

Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。

当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8
使用TRIzol注意事项
TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。

⒈样品的制备当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。

匀浆化后在2—8°C的条件下以12,000×g
的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。

在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。

在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤。

⒉分离阶段将匀浆样品在15—30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

每
1mlTRIZOL加0.2ml氯仿。

盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。

在2—8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。

离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。

RNA无一例外地存在于水样层当中。

水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的60%。

⒊RNA的沉淀将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。

通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。

最初均化时的每1mlTRIZOL对应0.5ml 异丙醇。

将混合的样品在15—30°C条件下孵育10分钟并在2—8°C下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10分钟。

RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4.RNA的洗脱移去上层悬液。

用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1ml的TRIZOL至少加1ml的75%乙醇。

旋涡振荡混合样品并在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。

⒌RNA的再溶解在操作的最后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5—10分钟）不要在真空管里离心干燥RNA。

尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低
它的可溶性。

部分溶解的RNA样品其A260/280比值<1.6。

用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5%SDS溶液来溶解RNA，并在55—60°C下孵育10分钟（当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。

）RNA还能被100%甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在–70°C。

配制方法
在2000ml的烧杯中加入以下物质，混合均匀：
500ml重蒸苯酚；
250g异硫氰酸胍；
293mL蒸馏水；
⒘6mL0.75M柠檬酸钠溶液（pH≥7）
26.4mL10%sarcosy（十二烷基肌氨酸钠）溶液
50mL2MNaAc溶液（pH≥4）
TRIzol需4℃低温保存，保质期约一年。

100mLTRIzol试剂市场售价约478元人民币。

注释：⑴水和苯酚部分互溶，Trizol中苯酚被水饱和，形成均匀溶液；⑵NaAc等盐类的作用是提供缓冲环境。

操作方法
1.匀浆处理:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,
用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

2.将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全
分离。

3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，
植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉
淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，
上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3
分钟。

5. 4 ℃10000×g离心15分钟。

样品分为三层：底层为黄色有机相，上
层为无色水相和一个中间层，
6.RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步
操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙
醇，室温放置10分钟。

8. 4 ℃10000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和
管底出现胶状沉淀。

移去上清。

9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。

2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空
离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。

加入25-200μl无RNase
的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用
于酶切反应,勿使用SDS溶液。

RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃
保存。

◆注意事项◆
1．从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。

例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。

糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

在用异丙醇沉淀RNA之前，加入5—10μg无RNA酶的脂质体(Cat.No 10814)作为水样层的载体。

为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。

脂质体会留在水样层中并和RNA共析出。

在浓缩到4 mg/ml之前它不会抑制第一丝状体的合成也不会抑制PCR。

2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。

RNA沉淀可以保存于75% 酒精中4 ℃一星期以上或-20℃一年以上。

3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg
总RNA反转录为cDNA
1准备2×RT Master Mix（一般为20μl 体系，需2×RT Master Mix 10μl）
10 2.0μl
250.8μl
10 2.0μl
1.0μl
-
4.2μl
2
RNase Inhibitor(Ribonuclease Inhibitor)，即RNases抑制剂，是一种大肠杆菌表
达的重组蛋白，可以通过非竞争性方式按1:1比例和RNase A、RNase B或RNase C结
合，并抑制这三种酶的活性，保护RNA不被这三种酶降解。

但本RNase Inhibitor不能
抑制RNase I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。

特点：不含DNA内切酶和外切酶，用于各种RNA相关反应，防止RNase的污染。

用途：用于cDNA合成，体外转录，体外翻译，以及mRNA-protein复合物分离纯化
等过程中保护RNA不被降解；还可用于特定RNase活性的鉴定等
2将2×RT Master Mix与RNA（10μl）混合均匀，根据如下建立反应条件：
1．试剂盒中所有试剂均需放置于冰上！
2．在准备2×RT Master Mix时，所有操作均需在冰上进行，并保证加入的各项试剂混合均匀。

3. 操作过程避免RNase污染，同时妥善保存提取RNA模板，以防降解。

PCR
利用Primer5设计引物
AGACCGTGACTGACTTTGGC
CAGTGGTCTGGACACCTCAC
PCR产物胶回收
胶回收试剂盒
(1)防止抽提过程中污染DNA酶
与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌(酶)处理,即使是不能用干热或湿热法灭菌的
器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶,不然可能发生回收片段部分降解的现象,有时甚
至一无所获.即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末端时也会导致严重的连接困难. (2)紫外照射选择长波段
回收过程往往需在紫外等监测下进行,与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯.
因为短波紫外线(254nm)会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体,前者会使以后的连接与转化等实验失败,后者可能造成基因突变,给克隆工作带来麻烦.即使是使用了长波紫外照射,回
收DNA时也要尽量短时照射,避免连续长时间照射.
(3)实验操作要轻柔
特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏,如吸取液体,转动离心管等操作
均应缓慢,轻柔.
(1)在紫外灯下切下尽可能小的含有目的DNA的琼脂糖凝胶，吸尽凝胶表面液体并切碎。

计算凝胶重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μL 体积）。

(2)在离心管中加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约10min）。

(3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp 时，加入1个凝胶体积的异丙醇。

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 mL离心管）中，12,000×g离心1 min.弃滤液。

(5)将制备管置回2 mL离心管，加500μL Buffer W1，12,000×g离心1min，弃滤液。

(6)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液。

以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1 min，弃滤液。

(7)将制备管置回2 mL离心管中，12,000×g离心1 min.
(8)将制备管放置于干净的1.5 mL离心管中，在制备膜中央加25-30μL Eluent或去离子水，室温静置1 min，12,000×g离心1 min洗脱DNA。

PCR产物的T载体连接
连接T载体总体系为10μL：0.5μL pMD 18-T Vector，2.5μL DNA，7μL Solution 1。

16℃反应3小时。

◆注意事项◆
1. Solution I务必在冰上融化！
2. 16℃条件连接，2000bp以下片段30min即可，2000bp以上可延长至数小时，时间不宜过长。

重组质粒的转化
将目的基因转入感受态细胞，步骤如下：
（1）从-70℃冰箱中取出保存的DH5α感受态细胞，立即置于冰盒上慢慢减冻。

（2）取5μL连接产物加入感受态细胞中，吹打混匀后冰浴30min。

（3）42℃热激90s，迅速转移至冰中，冰浴3-5min。

（4）加入预热的500μL LB液体培养基，37℃振荡培养50-60min。

(5)4000×g离心5min，吸取200μL后弃上清，吹打均匀后用玻璃棒涂于含Amp抗性的LB平板上。

(6)37℃恒温培养12h。

其中步骤1-5应在无菌条件下进行操作。

筛平板
PCR鉴定扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测，能扩增出目的条带的认为是阳性克隆
PCR反应体系
1．反应体系一般为20-25ul
2．摸板：菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul
3．引物：25umol/l 各0.5ul
4．dNTP : 0.5ul
5．10X Buffer: 如含Mgcl
2的为总体系的十分之一（2-2.5ul）,如不含Mg cl
2
，
应加入Mgcl
2
溶液1.5ul
6．Taq酶：0.5ul
7．加入Milli Q水，补齐至20-25ul
PCR参数
1．95-96℃ 3-5 min
2. 95-96℃ 30-40 Sec
3. (TM-5℃)一般为45-60℃ 30-40 Sec
4．72℃ 30-180 Sec（一般一分钟为1000个碱基）
5．72℃链延伸10 min
6. 10℃保存
质粒DNA的提取
（1）随机挑取生长于LB平板上的单个菌落，接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

（2）取1-4 mL在LB液体培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心5min，弃上清。

（3）加入250μL Buffer S1（含RNaseA）悬浮细菌沉淀，吹打均匀，漩祸震荡使细胞重悬。

（4）加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀，使菌体充分裂
解，直至形成透亮的溶液，室温静置4min。

（5）加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000×g离心10min。

（6）吸取步骤（5）中的离心上清液并转移到制备管（置于2mL离心管）中，12000×g 离心1min，弃滤液。

（7）将制备管置回离心管中，加入500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液。

（8）将制备管置回离心管中，加入700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液，以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液。

（9）将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min。

（10）将制备管移入新的1.5 mL离心管中。

在制备管中央加入65℃预热的60-80μL Eluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min。

酶切鉴定
通过限制性内切酶对质粒进行定向切割得到大小不同的片段，根据凝胶电泳对片段大小进行确认从而确定质粒的正确性或对确定大小的片段进行胶回收。

20μL酶切体系：
Buffer(10×) 2.0μL
质粒 3.0μL
限制性内切酶 1μL
灭菌去离子水 14μL
共20μL体系，37℃水浴3小时，1﹪琼脂糖凝胶电泳观察结果。

注意事项
1．反应体系尽可能的小。

2．酶切缓冲液为整个体系的十分之一。

内切酶的用量为反应体系的十至二十分之一（若为双酶切，则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一），酶用量过大可能反而不利于酶切（因为内切酶中含有甘油）。

3．DNA总量不宜大于2-3ug，否则在进行琼脂糖凝胶电泳时，会产生拖尾现象。

4．一般酶切温度为37℃水浴1-2h (小样鉴定1-2h，如要酶切回收，应切5-8h,特别是单酶切的载体，一定要切全,还应加去磷酸酶1-2h)。

5．一般小样鉴定为20ul总体系（酶一般用0.5ul），酶切回收为50-100ul总体系(酶一般用2-3ul，酶切3-4h后，可补加酶1ul)。

6．一般65℃水浴15分钟，灭活内切酶（也可不灭或，因为加入溴酚蓝后酶就失活了）。

7．用0.8-1.2%的琼脂糖凝胶电泳。

8．选择在目的基因及载体片段上均有酶切位点的酶，最好是单酶切。

9．酶切图谱越复杂越好，避免有近似大小的带。

10．请优先考虑HindIII、PvuII、DraI、KpnI、ApaI等性质稳定常用的内切酶。

11在双酶切过程中，应确定选用的酶是否共Buffer，若不共Buffer则通过TaKaRa公司商品目录中内切酶在不同Buffer下活动表选择适当Buffer，通常双酶切需要加入BSA以保证酶活性。