核酸分子原位杂交
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第四章 核酸分子原位杂交
核酸分子原位杂交技术的建立和发展 探针的类型、标记和鉴定
探针的类型和标记方法 探针的标记物 探针的鉴定 原位杂交的实验程序和对照
原位杂交的实验程序 对照实验 荧光原位杂交 原位多聚酶链式反应技术 核酸分子原位杂交技术的应用
原位杂交（in situ hybridization，ISH）是核酸分子杂交的一部分，是将 组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。 它是用标记了的 已知序列的核苷酸片段作为探针（probe），通过杂交直接在组织切片、细胞涂片、 培养细胞爬片或分裂中期染色体上检测和定位某一特定的靶核苷酸（DNA 或 RNA） 的存在。核酸原位杂交的生物化学基础是核酸的变性、复性和碱基互补配对结合。 根据所选用的探针和待检测靶序列的不同，核酸原位杂交有 DNA-DNA 杂交、 DNA-RNA 杂交和 RNA-RNA 杂交等。本章节将就核酸分子原位杂交技术的发展和应 用、探针的种类和标记、用非放射性标记探针行原位杂交的主要操作程序，以及 荧光原位杂交及原位 PCR 技术等进行介绍。
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化的裸探针或已标记好的探针，但后者的种类相对少，成本也高，远远不能满足 科研工作和实际应用的需求，常常需要自己寻找、自行设计和标记各种探针。现 在，我们已经可以购到商品化的用于各种类型探针标记的试剂盒，使相关的工作 得以简化。
一、 探针的类型和标记方法 （一）双链 DNA 探针（double stranded DNA probes） 双链 DNA 探针主要用于 DNA 的检测，也可用于 mRNA 序列的检测。双链 DNA 探针最常见的形式是在细菌的质粒上插入所需的 DNA 序列。双链 DNA 探针的标记 可用缺口平移法（nick translation）或随机引物法(random primer directed synthesis, RPDS)进行,由于 RPDS 法产生探针的量少（50ng/次），且多为短序列 的探针，而后者在原位杂交时易导致高的背景着色，故在一些实验室多选用缺口 平移法进行探针标记。不论用何种方法，标记出的探针的长度与反应体系中 DNA 酶和 DNA 聚合酶的比例有关，双链 DNA 探针的长度随缺口平移反应体系中 DNA 酶浓度的增高而变短，低浓度的 DNA 酶常产生 1500bp 左右的探针；而高浓度的 DNA 酶常产生 50～200bp 左右的探针。必要时可在标记后取少量探针行 1～2%的 琼脂糖电泳，以确定探针的分子大小。双链 DNA 探针在使用时需变性处理。 （二） 单链 cDNA 探针（single stranded cDNA probes） 单链 cDNA 探针可通过克隆含有所需核苷酸序列的噬菌体 M13 获得，但只克 隆 DNA 互补链中的一条有时是很困难的，尽管仅标记了所需的单链的核苷酸序 列，但未标记的模版仍以等浓度的水平存在于体系中。因此，在用单链 cDNA 探 针进行杂交时仍然需要变性处理，单链 cDNA 探针的优点是: ①不会发生因探针 的 自 身 粘 连 而 造 成 杂交 液 中 探 针 的 消 耗 ; ② 不 形 成 大 的 链 状 连 环 (large concatenates)以至于使探针难于渗入细胞内。单链 cDNA 探针的标记方法同双链 DNA 探针。该探针在原位杂交中较少使用。 （三） 单链 cRNA 探针 （single stranded cRNA probes） 单链 cRNA 探针可由构建的 RNA 表达载体而获得，在 RNA 聚合酶的作用下， 以 DNA 为模板合成反义 RNA 探针，同时也通过转录进行标记。近年来，单链 cRNA 探针正越来越多地用于 RNA 原位杂交检测 mRNA。一方面是因为 RNA-RNA 杂交形 成的杂交体较 DNA-RNA 杂交体(hybrid)的热稳定性好，而探针的大小也比较稳
自二十世纪八十年代起，用非放射性同位素标记探针进行原位杂交的报道 陆续出现。Baumann 等(1980)报告了用荧光素标记的探针进行原位杂交来检测特 定的 DNA 序列。Chollet 等(1985) 报告了用生物素标记人工合成的寡核苷酸探 针进行原位杂交的结果。Holtke 等(1990)报告了用地高辛标记探针进行原位杂 交的方法。 随着这些非放射性同位素标记探针的出现、商品化探针种类的不断 增加，以及方法学的不断改良和完善，相关新技术如荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）和原位聚合酶链式反应（ in situ polymerase chain reaction，in situ PCR）的出现等使原位杂交技术不仅在科研工作中得 到了越来越广泛的使用，并已步入临床医学检验之中，有了潜在的更加广阔的应 用前景。
生物的 dUTP 可经前述的多种方法直接掺入各种类型的探针上，利用生物素和卵白素 (avidin)或链亲和素(streptavidin)的高亲和性，再经相应的检测系统即杂交体 定位观察。需注意的问题是生物素也存在于人类的多种组织中，特别是肝，其次 是肾组织，在这类组织上使用生物素标记的探针进行杂交时，会有很强的背景着 色，影响杂交信号的观察。
寡核苷酸探针 末端(加尾)标记 特异性好、探针
mRNA
易制备、杂交时
DNA
间短
（四） 寡核苷酸探针(oligonucleotide probes) 寡核苷酸探针的长度以 30～50bp 为多见，若少于 20bp 时，该探针的特异性 将大打折扣。寡核苷酸探针可用 DNA 合成仪合成,经 PCR 扩增获得所需的量。人 工合成寡核苷酸探针的优点是：①当 DNA 序列未知时可根据氨基酸的组成进行合 成；②可用合成之不同序列的探针对特定基因进行筛选。由于寡核苷酸探针的片 段较其它类型的探针均短，故可用化学或酶法在其 DNA 序列的两端进行标记， 即 末 端 标 记 （ 又 称 加 尾 标 记 ）。 常 用 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 （ terminal deoxynucleotidyl transferase, TDT）进行 3’末端标记，也可用 T 4 多核苷 酸激酶（T4 polynucleotide kinase）进行 5’末端标记。由于寡核苷酸探针的 分子量小，与等量的双链 DNA 相比，其探针的浓度高；同时，在杂交中容易进入 细胞，故所需的杂交时间也短，一般为 2～4 小时。寡核苷酸探针多用于有高拷 贝的 mRNA 的检测。如浆细胞中免疫球蛋白κ和λ轻链 mRNA 的检测，以及 EB 病 毒编码的小分子 mRNA（EBER）的检测等，在临床外检中多用于病原微生物基因
核酸原位杂交技术的特点是特异性和敏感性高，与传统的生物化学方法做核 酸分子杂交的主要不同之处是原位杂交可对被检测的靶序列进行组织、细胞内定 位，因此，原位杂交能在成分复杂的组织中对某一个或一类细胞进行观察而不受 组织中其他成分的干扰；同时，原位杂交不需从待检组织中提取核酸，对组织中 含量较低的靶序列也有相对高的敏感性，并可完好地保存组织、细胞的形态结构， 将组织学表现与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。
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Harper 等(1986)的工作还发现用放射性同位素标记探针的原位杂交可检测到存 在于单个细胞内的低拷贝数的 mRNA 分子。随后，放射性同位素标记的寡核苷酸 探针也开始使用，主要用于原位检测 mRNA。自原位杂交技术建立以来，尽管它 具有高度敏感性和广阔的应用领域，但仍是在研究性实验室使用，这与放射性污 染、实验耗时和放射性自显影的高成本不无关系。
第二节 探针的类型、标记和鉴定
探针（probe）是经标记了的已知序列的核苷酸片段。用于原位杂交的 DNA 或 RNA 探针有双链 DNA 探针、单链 cDNA 探针、单链 cRNA 探针和合成的寡核苷酸 探针等，见表 4-1。探针的标记物有放射性同位素和荧光素、地高辛和生物素等 非放射性物质。用于组织或细胞原位杂交探针的长度以 50-300 个碱基(base pairs, bp)为宜，它不仅组织穿透性相对较强，而且杂交效果好；用于染色体原 位杂交的探针长度可达 1.2 -1.5 kb。探针的来源有多种途径，如直接购买商品
地高辛也是最常用的探针标记物之一，由于在人类和多种动物的组织中不存 在类似的物质，可以说是最佳的非放射性探针标记物，由于它也是半抗原，故与 FITC 标记探针的使用相似，连接酶标的抗地高辛抗体，经酶-底物作用，在光学 显微镜下观察结果。
三、探针的鉴定 对自己制备的探针的鉴定至少包括两个方面：一是探针长度的确认，特别是 对于由质粒的扩增、纯化和标记后所得到的探针是否为目的序列，应进行鉴定，
荧光素(如 FITC, Rodanmine 等)或其它化学发光物质（如 Cy3 等）标记探针 可用直接法进行原位杂交,如荧光原位杂交（FISH），所需时间短、操作简便、干 扰因素少，多用于新鲜或冷冻组织、细胞和染色体的原位杂交检测；不足之处有： 不论是自己用荧光素标记探针或直接购买成品荧光素标记，探针成本均较高，杂 交结果必须及时观察、照相或计算机采集图象，对相关设备条件的要求也高。由 于 FITC 也是半抗原，在用 FITC 标记的探针时，一方面可用直接法原位杂交，在 荧光显微镜下观察杂交体的荧光信号；另一方面，也可连接酶标的抗 FITC 抗体， 经酶-底物作用，在光学显微镜下观察结果。
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定，从而增加了杂交的敏感性。另一方面，由于该反义 RNA 探针不含载体的序列，
故减少了非特异的杂交，而在杂交后用 RNA 酶消化剩余的 RNA 探针，又降低了背
景的非特异着色。需注意的是做 RNA-RNA 杂交时要求灭活 RNA 酶的处理。
表 4-1 探针的类型、特性及优、缺点
探针类型
标记方法
优点
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最简单的方法就是行 1～2%的琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的位置来了解探针
的大小；二是对探针标记的强度进行检测或鉴定。以地高辛标记的探针为例，将
自己的目的探针和试剂盒提供的标准的未标记探针同时进行标记，再将这两个反
应的产物与试剂盒中提供的作为对照的标准的标记和未标记探针一起进行检测，
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组的检测。 二、 探针的标记物 探针标记物有放射性同位素如 3H 、35S、32P 、14C、125I 等，放射性同位素标
记探针的敏感性高，但有半衰期及放射性污染的危险性，成本也高且耗时（至少 需数天），故其使用受限。非放射性探针的标记物有荧光素（fluoresceins）、生 物素(biotin)和地高辛(digoxigenin, Dig) ,以及其它化学发光物质等，尽管其 敏感性不如放射性标记探针，但因其性能稳定、操作简便、成本低和耗时短等长 处，正越来越广泛地得到应用。下面对三种常用的非同位素标记物进行简要介绍。
第一节 核酸分子原位杂交技术的建立和发展
在 1969 年 Pardue 等和 John 在不同的地方几乎同时建立了核酸分子原位杂 交技术。当时，放射性同位素是唯一可用于核酸标记的物质，可用于原位杂交的 放射性同位素有 3H 、35S、32P、14C 和 I 125 等。而放射性自显影则是唯一可用于检 测杂交体的方法。由于分子克隆技术尚未建立，原位杂交技术只局限于少数能用 传统的生物化学方法进行纯化和分离的已知核酸序列的检测，如鼠的卫星 DNA、 病毒 DNA 和核小体 RNA 等。以后，随着核酸分子克隆技术的建立和放射标记方法 的不断完善，Harper 等(1981)、Jhanwag 等(1984)先后用放射性同位素标记探针 与分裂中期染色体行原位杂交，成功地检测到了长度为数百个核苷酸的序列。
缺点
检测对象
双链 DNA 探针
缺口平移法 随机引物法
特异性高
易 自 身 粘 DNA 连、使用前 mRNA 需变性处理
单链 DNA 探针
同上
不产生自身粘连 探针制备上 DNA
有难度
mRNA
单链 RNA 探针 通过转录进行 特异性高、形成 需 灭 活 RNA mRNA 的杂交体稳定、 酶处理 不产生自身粘连
核酸分子原位杂交技术的建立和发展 探针的类型、标记和鉴定
探针的类型和标记方法 探针的标记物 探针的鉴定 原位杂交的实验程序和对照
原位杂交的实验程序 对照实验 荧光原位杂交 原位多聚酶链式反应技术 核酸分子原位杂交技术的应用
原位杂交（in situ hybridization，ISH）是核酸分子杂交的一部分，是将 组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。 它是用标记了的 已知序列的核苷酸片段作为探针（probe），通过杂交直接在组织切片、细胞涂片、 培养细胞爬片或分裂中期染色体上检测和定位某一特定的靶核苷酸（DNA 或 RNA） 的存在。核酸原位杂交的生物化学基础是核酸的变性、复性和碱基互补配对结合。 根据所选用的探针和待检测靶序列的不同，核酸原位杂交有 DNA-DNA 杂交、 DNA-RNA 杂交和 RNA-RNA 杂交等。本章节将就核酸分子原位杂交技术的发展和应 用、探针的种类和标记、用非放射性标记探针行原位杂交的主要操作程序，以及 荧光原位杂交及原位 PCR 技术等进行介绍。
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化的裸探针或已标记好的探针，但后者的种类相对少，成本也高，远远不能满足 科研工作和实际应用的需求，常常需要自己寻找、自行设计和标记各种探针。现 在，我们已经可以购到商品化的用于各种类型探针标记的试剂盒，使相关的工作 得以简化。
一、 探针的类型和标记方法 （一）双链 DNA 探针（double stranded DNA probes） 双链 DNA 探针主要用于 DNA 的检测，也可用于 mRNA 序列的检测。双链 DNA 探针最常见的形式是在细菌的质粒上插入所需的 DNA 序列。双链 DNA 探针的标记 可用缺口平移法（nick translation）或随机引物法(random primer directed synthesis, RPDS)进行,由于 RPDS 法产生探针的量少（50ng/次），且多为短序列 的探针，而后者在原位杂交时易导致高的背景着色，故在一些实验室多选用缺口 平移法进行探针标记。不论用何种方法，标记出的探针的长度与反应体系中 DNA 酶和 DNA 聚合酶的比例有关，双链 DNA 探针的长度随缺口平移反应体系中 DNA 酶浓度的增高而变短，低浓度的 DNA 酶常产生 1500bp 左右的探针；而高浓度的 DNA 酶常产生 50～200bp 左右的探针。必要时可在标记后取少量探针行 1～2%的 琼脂糖电泳，以确定探针的分子大小。双链 DNA 探针在使用时需变性处理。 （二） 单链 cDNA 探针（single stranded cDNA probes） 单链 cDNA 探针可通过克隆含有所需核苷酸序列的噬菌体 M13 获得，但只克 隆 DNA 互补链中的一条有时是很困难的，尽管仅标记了所需的单链的核苷酸序 列，但未标记的模版仍以等浓度的水平存在于体系中。因此，在用单链 cDNA 探 针进行杂交时仍然需要变性处理，单链 cDNA 探针的优点是: ①不会发生因探针 的 自 身 粘 连 而 造 成 杂交 液 中 探 针 的 消 耗 ; ② 不 形 成 大 的 链 状 连 环 (large concatenates)以至于使探针难于渗入细胞内。单链 cDNA 探针的标记方法同双链 DNA 探针。该探针在原位杂交中较少使用。 （三） 单链 cRNA 探针 （single stranded cRNA probes） 单链 cRNA 探针可由构建的 RNA 表达载体而获得，在 RNA 聚合酶的作用下， 以 DNA 为模板合成反义 RNA 探针，同时也通过转录进行标记。近年来，单链 cRNA 探针正越来越多地用于 RNA 原位杂交检测 mRNA。一方面是因为 RNA-RNA 杂交形 成的杂交体较 DNA-RNA 杂交体(hybrid)的热稳定性好，而探针的大小也比较稳
自二十世纪八十年代起，用非放射性同位素标记探针进行原位杂交的报道 陆续出现。Baumann 等(1980)报告了用荧光素标记的探针进行原位杂交来检测特 定的 DNA 序列。Chollet 等(1985) 报告了用生物素标记人工合成的寡核苷酸探 针进行原位杂交的结果。Holtke 等(1990)报告了用地高辛标记探针进行原位杂 交的方法。 随着这些非放射性同位素标记探针的出现、商品化探针种类的不断 增加，以及方法学的不断改良和完善，相关新技术如荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）和原位聚合酶链式反应（ in situ polymerase chain reaction，in situ PCR）的出现等使原位杂交技术不仅在科研工作中得 到了越来越广泛的使用，并已步入临床医学检验之中，有了潜在的更加广阔的应 用前景。
生物的 dUTP 可经前述的多种方法直接掺入各种类型的探针上，利用生物素和卵白素 (avidin)或链亲和素(streptavidin)的高亲和性，再经相应的检测系统即杂交体 定位观察。需注意的问题是生物素也存在于人类的多种组织中，特别是肝，其次 是肾组织，在这类组织上使用生物素标记的探针进行杂交时，会有很强的背景着 色，影响杂交信号的观察。
寡核苷酸探针 末端(加尾)标记 特异性好、探针
mRNA
易制备、杂交时
DNA
间短
（四） 寡核苷酸探针(oligonucleotide probes) 寡核苷酸探针的长度以 30～50bp 为多见，若少于 20bp 时，该探针的特异性 将大打折扣。寡核苷酸探针可用 DNA 合成仪合成,经 PCR 扩增获得所需的量。人 工合成寡核苷酸探针的优点是：①当 DNA 序列未知时可根据氨基酸的组成进行合 成；②可用合成之不同序列的探针对特定基因进行筛选。由于寡核苷酸探针的片 段较其它类型的探针均短，故可用化学或酶法在其 DNA 序列的两端进行标记， 即 末 端 标 记 （ 又 称 加 尾 标 记 ）。 常 用 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 （ terminal deoxynucleotidyl transferase, TDT）进行 3’末端标记，也可用 T 4 多核苷 酸激酶（T4 polynucleotide kinase）进行 5’末端标记。由于寡核苷酸探针的 分子量小，与等量的双链 DNA 相比，其探针的浓度高；同时，在杂交中容易进入 细胞，故所需的杂交时间也短，一般为 2～4 小时。寡核苷酸探针多用于有高拷 贝的 mRNA 的检测。如浆细胞中免疫球蛋白κ和λ轻链 mRNA 的检测，以及 EB 病 毒编码的小分子 mRNA（EBER）的检测等，在临床外检中多用于病原微生物基因
核酸原位杂交技术的特点是特异性和敏感性高，与传统的生物化学方法做核 酸分子杂交的主要不同之处是原位杂交可对被检测的靶序列进行组织、细胞内定 位，因此，原位杂交能在成分复杂的组织中对某一个或一类细胞进行观察而不受 组织中其他成分的干扰；同时，原位杂交不需从待检组织中提取核酸，对组织中 含量较低的靶序列也有相对高的敏感性，并可完好地保存组织、细胞的形态结构， 将组织学表现与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。
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Harper 等(1986)的工作还发现用放射性同位素标记探针的原位杂交可检测到存 在于单个细胞内的低拷贝数的 mRNA 分子。随后，放射性同位素标记的寡核苷酸 探针也开始使用，主要用于原位检测 mRNA。自原位杂交技术建立以来，尽管它 具有高度敏感性和广阔的应用领域，但仍是在研究性实验室使用，这与放射性污 染、实验耗时和放射性自显影的高成本不无关系。
第二节 探针的类型、标记和鉴定
探针（probe）是经标记了的已知序列的核苷酸片段。用于原位杂交的 DNA 或 RNA 探针有双链 DNA 探针、单链 cDNA 探针、单链 cRNA 探针和合成的寡核苷酸 探针等，见表 4-1。探针的标记物有放射性同位素和荧光素、地高辛和生物素等 非放射性物质。用于组织或细胞原位杂交探针的长度以 50-300 个碱基(base pairs, bp)为宜，它不仅组织穿透性相对较强，而且杂交效果好；用于染色体原 位杂交的探针长度可达 1.2 -1.5 kb。探针的来源有多种途径，如直接购买商品
地高辛也是最常用的探针标记物之一，由于在人类和多种动物的组织中不存 在类似的物质，可以说是最佳的非放射性探针标记物，由于它也是半抗原，故与 FITC 标记探针的使用相似，连接酶标的抗地高辛抗体，经酶-底物作用，在光学 显微镜下观察结果。
三、探针的鉴定 对自己制备的探针的鉴定至少包括两个方面：一是探针长度的确认，特别是 对于由质粒的扩增、纯化和标记后所得到的探针是否为目的序列，应进行鉴定，
荧光素(如 FITC, Rodanmine 等)或其它化学发光物质（如 Cy3 等）标记探针 可用直接法进行原位杂交,如荧光原位杂交（FISH），所需时间短、操作简便、干 扰因素少，多用于新鲜或冷冻组织、细胞和染色体的原位杂交检测；不足之处有： 不论是自己用荧光素标记探针或直接购买成品荧光素标记，探针成本均较高，杂 交结果必须及时观察、照相或计算机采集图象，对相关设备条件的要求也高。由 于 FITC 也是半抗原，在用 FITC 标记的探针时，一方面可用直接法原位杂交，在 荧光显微镜下观察杂交体的荧光信号；另一方面，也可连接酶标的抗 FITC 抗体， 经酶-底物作用，在光学显微镜下观察结果。
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定，从而增加了杂交的敏感性。另一方面，由于该反义 RNA 探针不含载体的序列，
故减少了非特异的杂交，而在杂交后用 RNA 酶消化剩余的 RNA 探针，又降低了背
景的非特异着色。需注意的是做 RNA-RNA 杂交时要求灭活 RNA 酶的处理。
表 4-1 探针的类型、特性及优、缺点
探针类型
标记方法
优点
5
最简单的方法就是行 1～2%的琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的位置来了解探针
的大小；二是对探针标记的强度进行检测或鉴定。以地高辛标记的探针为例，将
自己的目的探针和试剂盒提供的标准的未标记探针同时进行标记，再将这两个反
应的产物与试剂盒中提供的作为对照的标准的标记和未标记探针一起进行检测，
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组的检测。 二、 探针的标记物 探针标记物有放射性同位素如 3H 、35S、32P 、14C、125I 等，放射性同位素标
记探针的敏感性高，但有半衰期及放射性污染的危险性，成本也高且耗时（至少 需数天），故其使用受限。非放射性探针的标记物有荧光素（fluoresceins）、生 物素(biotin)和地高辛(digoxigenin, Dig) ,以及其它化学发光物质等，尽管其 敏感性不如放射性标记探针，但因其性能稳定、操作简便、成本低和耗时短等长 处，正越来越广泛地得到应用。下面对三种常用的非同位素标记物进行简要介绍。
第一节 核酸分子原位杂交技术的建立和发展
在 1969 年 Pardue 等和 John 在不同的地方几乎同时建立了核酸分子原位杂 交技术。当时，放射性同位素是唯一可用于核酸标记的物质，可用于原位杂交的 放射性同位素有 3H 、35S、32P、14C 和 I 125 等。而放射性自显影则是唯一可用于检 测杂交体的方法。由于分子克隆技术尚未建立，原位杂交技术只局限于少数能用 传统的生物化学方法进行纯化和分离的已知核酸序列的检测，如鼠的卫星 DNA、 病毒 DNA 和核小体 RNA 等。以后，随着核酸分子克隆技术的建立和放射标记方法 的不断完善，Harper 等(1981)、Jhanwag 等(1984)先后用放射性同位素标记探针 与分裂中期染色体行原位杂交，成功地检测到了长度为数百个核苷酸的序列。
缺点
检测对象
双链 DNA 探针
缺口平移法 随机引物法
特异性高
易 自 身 粘 DNA 连、使用前 mRNA 需变性处理
单链 DNA 探针
同上
不产生自身粘连 探针制备上 DNA
有难度
mRNA
单链 RNA 探针 通过转录进行 特异性高、形成 需 灭 活 RNA mRNA 的杂交体稳定、 酶处理 不产生自身粘连