纯化痘病毒筛选的常用方法

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综述
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纯化痘病毒筛选的常用方法
方敬敬1,2　唐慧2
DOI ：10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2019.09.008
基金项目：国家自然科学基金项目（81460463）；云南省中青年学术技术带头人后备人才培养基金（2013HB083）；云南省卫生和计划生育委员会医学学科带头人培养基金（D-201642）
作者单位：650504　昆明理工大学医学院1；650032　云南省第一人民医院，昆明理工大学附属医院，临床基础医学研究所，云南省临床病毒学重点实验室，昆明市肿瘤分子与免疫防治重点实验室2
通信作者：唐慧，Email ：htang1122@
【摘要】　痘病毒是自然界普遍存在的DNA 病毒，能够高效表达外源基因，诱导较强的细胞免疫和体液免疫，受到基因治疗学者的广泛关注。

痘病毒发生同源重组的概率较低，所以有效地筛选和纯化痘病毒十分重要。

目前常用的筛选重组痘病毒方法有基于CRISPR 进行筛选；根据报告基因GFP 、LacZ 、GPT 等进行筛选；利用TK -和Brdu 结合荧光进行筛选；利用药物抗性基因与荧光或显色基因融合，即可在药物筛选的同时观察荧光或显色基因表达情况。

本文旨在对目前常用的痘病毒的筛选纯化方法进行综述。

【关键词】　痘病毒；　筛选
Commonly used methods for screening and purifying vaccinia virus Fang Jingjing 1,2, Tang Hui 2.
1
College of Medicine, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650504, China; 2Institute
of Basic Medical Sciences, Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, The First People′s Hospital of Yunnan Province, Yunnan Provincial Key Laboratory of Clinical Virology, Kunming Key Laboratory of Tumor Molecular & Immune Prevention, Kunming 650032, China Corresponding author: Tang Hui, Email: htang1122@
【Abstract 】　Vaccinia virus is a ubiquitous DNA virus in nature. It can express exogenous genes efficiently and induce both humoral and cellular immunity. This property has made it become a hot topic in gene therapy research. Since the probability of homologous recombination is low, effective screening and purification of vaccinia virus is very important. At present, the commonly used methods for screening vaccinia virus are based on the use of reporter genes, such as GFP, LacZ, gpt, and other genes, or the use of TK - and Brdu combined with fluorescence. Some scholars have tried to fuse drug resistance gene, fluorescence, and chromogenic genes to carry out drug screening and observe gene expression. In this article, we will make a summary of the commonly used methods for vaccinia virus screening and purification, and compare their advantages and disadvantages.
【Key words 】　Vaccinia virus;　Screening method 1798年Jenner 证实了人接种牛痘病毒后可产生抗原反应，用于防止部分外源病毒的侵染，如天花病毒等。

此外，牛痘病毒对肿瘤患者也有一定的治疗作用，其可使肿瘤短暂性消失，这为病毒治疗肿瘤提供了新思路［1］。

Liu ［2］提出了癌症的靶向基因-病毒治疗的概念，并进行了体内和体外试验，结果表明病毒疗法可一定程度上杀灭部分肿瘤。

基于以上结论，Zhang 等［3］开发了靶向双基因-病毒治疗
（cancer targeting dual gene-viro-therapy ，CTGVT-DG ）策略。

以上研究均证实了病毒作为肿瘤基因治疗载体的可行性，且在痘苗家族中，目前对牛痘病毒的研究最为广泛［4-5］。

这主要是由于痘病毒作为载体具有以下优点：（1）安全性较高，不会整合入宿主体内；（2）宿主选择区域广，侵染范围大，可表达部分蛋白，可接种至大部分动物细胞内； （3）可作为研究免疫应答的工具，能刺激机体产生有效的体液和细胞免疫；（4）病毒感染细胞后，可于一定期限内消亡，进而产生抗原反应，该作用是病毒治疗肿瘤的主要
机制。

但重组痘病毒的构建具有一定难度，主要原因是痘病毒不易产生同源重组现象，其概率一般＜0.01%［6］，所以应加强对重组痘病毒的筛选，以实现重组痘病毒的纯化。

1982年Mackett 对痘病毒进行了深入研究，完成了重组病毒的构建。

为有效分离和筛选重组病毒，很多学者采用不
同的方法实现了重组病毒的筛选，如抗生素、胸苷激酶（TK）表型、噬斑形态、颜色标记、CRISPR等（表1）。

对于标记了如GFP、EGFP、LacZ、GPT、tomato red等报告基因的重组痘病毒，可通过荧光显微成像或目测来进行监测［13-15］；对于表达β-半乳糖苷酶［16］和β-葡萄糖醛酸酶的重组痘病毒，借助其能将底物转化为有颜色的物质或表达荧光蛋白的特性，可通过目测或借助仪器将目的蚀斑筛选出来［17］。

对于携带了TK表型的重组痘病毒，通常利用酶酚酸和新霉素等药物来进行筛选［18］。

以下将目前常用的重组痘病毒的筛选纯化方法作一综述。

一、基于CRISPR进行筛选
1.筛选原理：CRISPR系统是细菌特有的免疫系统。

病毒可将自身的基因整合到细菌，并利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可将病毒基因从自己的染色体上切除。

2.筛选方法：利用CRISPR文库开展遗传学筛选需以下步骤：（1）将文库扩增一定程度，足以产生病毒，检查扩增前后每个gRNA的比例；（2）用含有CRISPR文库的病毒转导细胞，产生突变细胞的异质群体，使每组细胞产生不同基因的突变；（3）利用药物的选择或基于荧光细胞的分选来富集突变细胞，并筛选特定表型。

如突变细胞可在药物筛选中赋予耐压性的基因。

3.筛选方法的优缺点：CRISPR具有廉价、迅速、简单，可以覆盖多数区域的基因编辑需求等优点。

但最近研究发现，CRISPR系统实际操作难度大，主要原因为质粒较大，转染难度较大；具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且会导致不同基因位点编辑效率不同。

此外，在人类癌细胞系列中，CRISPR也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做出了修改。

二、根据GFP、EGFP或GPT报告基因联合药物筛选
1.筛选原理：GFP蛋白是一种氨基酸数量为238个的单肽链蛋白质。

该蛋白存在于海洋水母中，由Morie等学者于1974年分离出来，其用蓝色光激发可以产生绿色荧光。

GFP基因广泛用于基因表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等方面。

主要原理为GFP基因经过表达并转化为蛋白后在紫外光下呈现为绿色，N端（1-154）和C端（155-238）分别与不同的融合蛋白相连；若该不同的蛋白发生某种特定的反应并相互作用，将N端和C端靠近可实现功能的拓展，进而形成特定的荧光蛋白；若该两类蛋白不能发生反应，则荧光蛋白就无法获得。

因此建立GFP基因的重组痘病毒，根据是否具有荧光特性来进行筛选。

GFP蛋白经改造后可形成增强GFP蛋白，即EGFP蛋白，其原理上与GFP相似。

重组痘病毒含有葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，GPT），GPT基因编码的GPT蛋白可使重组病毒在霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤存在的情况下生长，所以可以通过药物筛选来富集目的病毒［19］。

鸟嘌呤在痘病毒繁殖中发挥着重要作用，其合成过程需要多种酶的共同参与，如肌苷酸脱氢酶。

该酶的活性在一定条件下受多种物质的制约，如黄嘌呤和次黄嘌呤。

肌苷酸脱氢酶活性的下降将直接影响鸟嘌呤的合成以及痘病毒的复制。

GPT基因的存在为鸟嘌呤的合成开辟了新途径，进而保证病毒复制过程的正常进行。

目的病毒与野生型病毒中含GFP基因时，前者可进行复制，而后者复制过程受到制约，导致复制失败，由此可将目的病毒筛选出来。

2.筛选方法：通过将不同浓度的病毒液感染目的细胞，细胞出现病变后，在荧光显微镜下可以观察到发绿色荧光的噬斑，按照此方法进行纯化，还可加入抗生素如霉酚酸、黄嘌呤以及次黄嘌呤进行进一步的筛选，直至得到完全纯化的重组痘病毒。

3.筛选方法的优缺点：GFP在分子标记中具有许多重要作用，其主要优势为：（1）敏感度高，实际操作中无需其他物质的辅助，便于观察；（2）对转录因子、翻译释放因子、微观蛋白等其他蛋白不会产生有害作用；（3）自主性表达，表达范围广，检测过程简便易行。

GFP是一种常见的报告基因，具有安全性高、易于观察等特性，在转基因载体等领域应用广泛。

但GFP的大小会在体内影响目的基因和蛋白的功能，并且GFP的敏感度较低，其信号不能被外界放大［8］。

EGFP的荧光强度是GFP的6倍以上，因此其筛选效果优于GFP。

EGFP感染细胞具有体外传代，表达时间长、效率高的优点，一般持续表达时间可达2~3个月左右，因此，EGFP可充当细胞标记蛋白。

使用EGFP作为报告基因进行重组病毒筛选的优势为：（1）依据荧光原理可
表1　重组痘病毒经常使用的报告基因
报告基因起源产物检测
LacZ［7］Escherichia coliβ-galactosidase Colorimetry
GFP［8］Aequorea Victoria (jellyfish)Green luorescent protein Fluorescence
LUC［9］Photinus pyralis and bacteria Luciferase Luminescence
GUS［10］Escherichia coliβ-galactosidase Colorimetry or fluorescence
CAT［11-12］Escherichia coli Chloramphenicol acetyltransferase Thin-layer chromatography autoradiography, ELISA
实现对重组率的评价，进而为重组病毒的筛选奠定基础；（2）比传统方法更直观，操作性较强；（3）筛选效率高，耗时短，通常以往的筛选耗时较长，一般为3~4个月，而采用EGFP法筛选蚀斑，仅需1周左右；（4）不需要借助贵重仪器即可分离重组病毒；（5）不需添加抗生素和反应底物，比传统方法更加经济。

但其缺点是，相对人体，GFP是一种异种蛋白，经筛选后的病毒无法实现人体内的应用。

三、利用LacZ报告基因筛选
1.筛选原理：LacZ基因是载体的重要组成部分，而该基因内分布有外源DNA的多克隆位点。

正常情况下即外源DNA未插入时，该基因可进行β-半乳糖苷酶的表达和X-gal底物的分解，前一过程需要异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyi β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）的参与，IPTG在此过程中起诱导作用；后一过程中该基因可分解X-gal底物，使其呈蓝色；而当外源DNA插入载体时，该基因的以上功能则全部消失，β-半乳糖苷酶表达受阻，形成的菌落呈白色，该白色菌落即为含目的重组基因的重组子［7，20-21］。

2.筛选方法：感染后的病毒液反复冻融后倍比稀释接种细胞，感染后加入低熔点琼脂糖的培养基，用含X-gal 的培养基进行培养，将挑取白斑复冻融3次后进行下一轮蚀斑纯化。

3.筛选方法的优缺点：载体上的标记基因LacZ，当外源DNA准确导入LacZ基因时，重组和非重组噬菌斑分别呈无色和蓝色。

蓝白斑筛选法是最传统的方法，该法可实现对外源DNA分子的检测，以检验其是否完成与载体的连接和载体所处部位，并且成本低，无需特定的装置检测，可通过目测即可获得重组病毒噬菌斑［22］。

值得注意的是，尽管在一定程度上标记基因可作为外源DNA导入的判断依据，但其功能的表达仍受多种因素的制约，如诱导作用等。

因此，单一的标记基因法判断外源DNA分子的导入具有一定的局限性，应综合多种技术进行判定，如免疫杂交、PCR技术等。

此外，该方法操作步骤较繁琐，耗时较长，并且仅在病毒较为纯化的情况下才能产生蓝白斑，前期筛选的工作量较大，同时lacZ序列较长，可能会对转染以及重组的效率产生负面影响。

四、甲基纤维素噬斑法
1.筛选原理：甲基纤维素噬斑法是传统噬斑法的改良版。

甲基纤维素蚀斑法的作用原理为：对重组痘苗病毒进行梯度稀释，将稀释后的病毒转移至单层细胞上，使病毒进入细胞内部。

将经病毒感染的细胞接种至营养半固体培养基，防止病毒在细胞内部扩散。

经病毒感染的区域形成局部病变，并将此区域命名为噬斑区。

病毒感染细胞后会阻碍细胞部分正常功能的行使，如活性染料染色作用消失等，利用该特性可将其与正常细胞进行区分。

2.筛选方法：倍比稀释的痘病毒感染猴肾细胞，用甲基纤维素覆盖，结晶紫染色后挑取噬斑。

3.甲基纤维素噬斑法的优缺点：甲基纤维素噬斑法相较于传统方法，可形成均匀、清晰的噬斑，复孔重复性好，而且蚀斑在实验后2年内保存完好，与背景形成明显对比，便于复查，省时省力节约成本且便于操作，是一个值得推广的筛选纯化方法。

五、Brdu/Luc双重筛选法
1.筛选原理：TK基因在DNA合成中发挥着重要作用，主要作用于细胞增殖期。

在病毒复制过程中，该基因可形成核苷酸池，为子代DNA复制提供前提条件，该过程需要TK的参与。

正常情况下，细胞内核苷酸浓度较低，而肿瘤细胞中含有较多的核苷酸，当痘病毒TK基因缺失时，该病毒可在肿瘤细胞内进行增殖，增加了对肿瘤细胞的靶向性而对正常细胞无损伤。

5-溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，Brdu）实质上是一种类核苷酸化合物，其化学组成和性质与胸腺嘧啶较为类似，当该物质被TK催化后，可进入病毒基因组，进而抑制病毒核酸的合成。

故在Brdu存在的条件下，只有TK缺陷型（TK-）病毒能够复制，借此即筛选出了能在细胞中增殖并表达报告基因的TK基因缺陷型的TK-病毒［18］。

筛选表达外源基因的痘病毒，当外源基插入痘病毒基因组时，可伴随其他基因的插入，如报告基因等，用于基因的筛选，如可通过加入底物与报告基因的蛋白产物产生生物发光或可形成不同病毒蚀斑颜色的报告基因等，如萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase，Luc）报告基因可作用于其底物荧光素产生生物发光反应，借助小动物活体成像系统检测其信号值。

2.筛选方法：混合病毒液倍比稀释接种细胞，培养24 h 后，加入1‰荧光素酶底物并置于小动物活体成像系统下检测，用记号笔标记有荧光活性的孔。

收集荧光素酶活性且稀释度均高的孔内病毒混合液，重复冻融并用超声波处理；重复上述痘病毒阳性重组子筛选纯化过程共8~10次，获得纯化的痘病毒阳性重组子。

3. Brdu/Luc双重筛选法优缺点：Brdu/Luc双重筛选法与其他检测方法相比，有很高的敏感度，此外Luc系统更加直接、快速，使用这种方法筛选重组痘病毒，大大减少了筛选重组痘病毒的工作量。

但这种方法需要超灵敏电荷耦合器件摄像机来检测基因的表达［23］。

六、展望
应用痘病毒载体进行肿瘤基因治疗有着广阔的应用前景。

在痘病毒载体制备过程中，筛选并获得纯化的痘病毒尤为重要。

目前筛选重组痘病毒常用的方法有：借助报告基因GFP、LacZ、GPT等进行筛选；利用TK-和Brdu结合荧光进行筛选；利用药物抗性基因与荧光或显色基因融合，即可在药物筛选的同时观察荧光或显色基因表达情况。

但需注意的是，这些常用的筛选纯化方法同时也存在许多
缺点：如使用某些标记基因会引入某些突变，故克服这些问题并优化重组痘病毒的筛选纯化方法十分重要［24-25］。

近年来，研究出了一些策略以避免使用标记或筛选基因所带来的负面风险，常用的方法是在获得纯化的重组子之后，再移除其携带的报告或筛选基因［24］，但目前这些方法仍在探索中，尚需更多的体外和体内实验数据证实。

总之，对重组溶瘤病毒筛选纯化的方法进行优化，开发更安全、更有效的重组溶瘤病毒筛选纯化新方法将极大的推动重组痘病毒在肿瘤基因治疗领域的应用。

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（本文编辑：史晓娟）
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