可乐中咖啡因含量的测定(徐艳清)

浙江科技学院生物与化学工程学院
仪器分析实验报告
姓名：徐艳清学号：3110422005 班级：化工专升本111班
实验名称：饮料中咖啡因的高效液相色谱分析——外标法定量一、实验目的
<1）熟悉高效液相色谱仪的结构，并熟悉其分析操作；
<2）理解反相化学键合相色谱法的原理与应用；
<3）学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量。

二、实验原理
咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7—三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。

咖啡因在咖啡中的含量约为 1.2%~1.8%，在茶叶中约为 2.0~4.7%。

可乐饮料、止痛药等含咖啡因。

咖啡因的分子式为，其化学结构式如下图：
在化学键合相色谱法中，若采用的流动相极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。

该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。

本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。

由于在一定的实验条件下，同一组分的保留值保持恒定，因此在同种条件下，将发酵产物中各组分的保留时间与标准品对照，即可确定该组分存在与否。

本实验采用峰面积进行含量计算。

通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。

三、实验步骤
(1>将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15min；
(2>系统除气泡：大流速泵抽；装柱子：小流速装柱；(3> 平衡：流速由小至大，配比缓慢增加至压力恒定；(4>精密配制含咖啡因浓度为约1mg•mL-1的咖啡因甲醇溶液。

将此甲醇稀释
为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg•mL-1等5份对照溶液；
(5>根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平
衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析；
(6>依次分别吸取5μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据；(7>将可乐试样稀释一倍，经超声波脱气后，精密吸取5μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据；(8>实验完成后，按要求关好仪器。

四、实验条件<1）实验试剂及设备：
—Waters 1525-2996系统
—Hypersil ODS2 5um色谱柱
—Millipore 纯水过滤器
—4.5um F型过滤膜
—甲醇HPLC级
—标准品:含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg•mL-1等
5份对照品溶液
—试样：市售可乐
<2）仪器条件：
—流动相：等度为60:40<甲醇：水）
—检测波长：254
—进样量：5μL
—运行时间：6min
—积分：自动积分
五、数据记录及处理<附原始图）<1）标准品图谱如下：
<2）样品图谱如下：
<3）紫外图谱如下：
定性结论：
根据标准品谱图、样品图谱的保留时间，可初步判断是咖啡因；
根据咖啡因的紫外图谱与标准咖啡因的紫外图谱波长272.9nm比较可确定该组分是咖啡因。

<4）处理色谱数据，将系列对照品溶液与可乐试样的咖啡因色谱峰保留时间及峰面积列于下表中：
<5）绘制咖啡因峰面积—质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。

定量结论：
标准曲线方程：y=8190x-10266
式中：y表示色谱峰面积A，x表示咖啡因的质量浓度m.
稀释一倍后的可乐试样色谱峰面积A=302481，
根据302481=8190x-10266,可得x=38.19μg•mL-1.
即稀释一倍后的可乐试样中咖啡因的浓度为38.19μg•mL-1.
所以原可乐试样中咖啡因的浓度为76.38μg•mL-1.
六、问题与讨论
1、问题思考
<1）用标准曲线法定量有什么优缺点？
答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。

标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件<检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。

此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品<或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

<2）根据咖啡因的结构特点，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？答：不行。

因为离子交换色谱<ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。

当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。

根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。

平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。

由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。

亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。

依据咖啡因的结构式1,3,7-三甲基黄嘌呤，其解离常数很小，所以不符合离子交换色谱的要求。

<3）采用咖啡因浓度与色谱峰高作回归曲线，能给出准确的测试结果吗？与本实验的峰面积-浓度回归曲线相比，哪一种方法更好一些？
答：一般来说峰面积相对更准一些，高度是不准的，毕竟还涉及到峰宽的问题。

用峰高来定量，如果峰形不好，比如说有拖尾，用峰高就不太准确。

如果用峰高对峰面积也是可以的，但对峰的对称性要求比较高，药典要求应该是对称因子得是0.95 ~ 1.05之间，色谱条件要求比较高，如果能达到要求也是可以的。

所以一般用峰面积定量更好些。

2、讨论
（1）进样一定要使用平头进样微量针进行进样，这也是与气相色谱进样的最大区别。

（2）每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

可乐在使用前必须用滤膜过滤，以出去微小微粒，防止色谱柱堵塞。

同时要进行超声波脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或样品池中以气泡形式逸出，使得压力不稳定，导致重现性差，所以在使用过程中也应尽量避免产生气泡。

在样品干过滤时，要弃去前过滤液，因为前过滤液有一些杂质的存在，而且干过滤是为了分离掉溶液中的固体，并且保持溶液浓度不变而采取的一种方法，所以要将前液去掉。

同时，盛接滤液的容器要干燥的，这样做才不会影响实验结果。

（5）为获得良好的实验效果，标样和样品的进样量要严格保持一致。

通过紫外谱图与高效液相色谱中标准谱图的联合应用，可以快速、准确地对可乐中咖啡因进行定性且定量分析，而且溶剂用量少。

在液相色谱中，当样品组成复杂时，有时会出现先出的峰分不开，后面
的峰保留值又太大的现象，这时，可以采用梯度洗脱来调整混合溶剂的
组成，改变溶剂强度或选择性。

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