流式细胞仪在凋亡检测中的应用

流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
随着流式细胞术检测技术的发展以及越来越多的荧光探针、检测试剂盒的出现，应用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测成为细胞凋亡研究中的新手段。

流式细胞术检测细胞凋亡是通过检测其光射特征及荧光参数进行的。

1 光散射法检测细胞凋亡：在流式细胞仪系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时，经激光照射，细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线，其中前向散射光(forward scatter,FSC)的强度与细胞大小有关，而侧向散射光(side scatte,SSC)的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。

细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，核碎裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞FSC降低而SSC增高。

细胞坏死由于胞体肿胀，细胞核亦碎裂解，故FSC和SCC均增高。

正常细胞FSC高而SSC低。

根据光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来，用以区别辨认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型，也可用于活细胞分类。

根据FSC和SSC判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大，因此在某此淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。

2碘化丙啶染色法检测细胞凋亡：碘化丙啶是常用的DNA染料，属于插入性荧光染料，可选择性定量嵌入DNA/RNA双螺旋结构中，受激后发射波长为620nm，由于碘化丙啶不能通过活细胞膜进入细胞内染色，因此具体操作用要用细胞经体积分数为70%的乙醇在细胞膜上打孔，把染料引入细胞内并将细胞固定。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，即凋亡峰(apoptotic peak,AP),代表凋亡细胞。

根据此亚二倍体峰可以计算细胞的凋亡指数。

此方法优点是可定量检测，灵敏度高。

缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别坏死细胞和凋亡细胞。

3 罗丹明123染色法检测细胞凋亡：
对于凋亡过程中线粒体膜电位的变化，经常采用罗丹明123荧光染料来进行检测。

细胞膜电位是由于细胞膜两侧离子分布的不对称性而产生的。

细胞凋亡过程中常伴有线粒体膜电位的下降，并且出现在核的变化之前。

研究表明线粒体膜电位的变化是参与细胞凋亡的一个重要组成部分，多种凋亡诱导分子可以通过诱导Bcl-2家族(如Bax)的高表达而直接引起线粒体膜电位的改变，从而释放细胞色素C等凋亡诱导物质，诱导细胞进上步凋亡。

这个过程常受抑制凋亡分子
Bcl-2的调节。

4 Fluo-3 染色法检测细胞凋亡：细胞凋亡与细胞内Ca2+浓度密切相关，不同的刺激信号通过复杂的信息传递途径引起Ca2+浓度的变化。

Ca2+通道蛋白Br-A 23187诱导的胸腺细胞凋亡是由于Ca2+浓度的持续升高激活了Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶(Ca2+/Mg2+-ENase), 将基因组DNA在核小体间降解为180～200bp或其倍数的片段。

Fluo-3 是最新一代的钙离子荧光指示剂，它在可见光谱激发，激发波长488nm，因而减少了需紫外光作激发时对活细胞的光损伤。

Fluo-3是兴奋峰值位于560nm，其Ca2+结合式荧光强度较游离形式高40～100倍，因而避免自发荧光的干扰。

Fluo-3与Ca2+亲和力低，容易解离。

由游离钙形式结合和转化时荧光强度改变最大，因此适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。

用已知Ca2+浓度的Ca2+/EGTA缓冲液绘制标准曲线，然后用流式细胞仪测出细胞的荧光强度，从标准曲线查出其Ca2+浓度值。