米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析

生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
第18卷第3期2023年6月
V ol.18,No.3Jun.2023
㊀㊀基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(42106203)
㊀㊀第一作者:杨桂琴(1995 ),女,硕士研究生,研究方向为水产动物病害及免疫学,E -mail:*****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:********************
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220806001
杨桂琴,李晓东,路玮静,等.米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析[J].生态毒理学报,2023,18(3):312-325
Yang G Q,Li X D,Lu W J,et al.Transcriptome analysis about effect of Karenia mikimotoi on Oryzias melastigma [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):312-325(in Chinese)
米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析
杨桂琴1,李晓东1,*,路玮静1,李健鑫1,李靖2,常阳1,王紫阳1,张伟妮1,3,陈新华1
1.福建农林大学海洋学院,福建省海洋生物技术重点实验室,福州350002
2.闽江学院,福州海洋研究院,福建省海洋生物多样性保护与永续利用重点实验室,福州350108
3.福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室,福州350002收稿日期:2022-08-06㊀㊀录用日期:2022-10-07
摘要:近年来我国近岸米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi )藻华频发,给当地水产养殖业带来严重的损失,但该藻在海洋生物分子水平上的影响尚不明确㊂本实验通过转录组学分析,探究了米氏凯伦藻对模式生物海水青鳉(Oryzias melastigma )鳃和肝脏mRNA 转录水平的影响㊂结果发现受藻作用96h 后,青鳉鳃与肝脏中分别有508个与604个差异表达基因(differentially ex -pressed genes,DEGs),其中上调基因分别有184个和390个,下调基因分别有324个和214个㊂Gene ontology (GO)功能分类结果显示DEGs 多集中于生物进程和分子功能,进一步GO 富集分析结果表明,米氏凯伦藻能够显著影响青鳉鳃组织中凝血酶激活受体活性㊁受体信号通路和离子跨膜运输等相关通路;肝脏中氧运输和结合进程相关通路也受到显著影响㊂Kyoto ency -clopedia of genes and genomes (KEGG)功能富集分析表明鳃和肝脏组织中DEGs 均显著富集于免疫系统的补体和凝血级联反应,鳃DEGs 还富集在IL -17免疫信号分子和细胞因子相互作用信号转导通路;而肝脏DEGs 还富集在脂质㊁氨基酸代谢通路㊂此外,免疫因子serpine1㊁hsp90b1㊁bcl2l1在鳃中均被显著抑制,而凝血因子f2㊁f5㊁plg 在肝脏中均被显著上调㊂实验结果表明米氏凯伦藻可能对海水青鳉鳃造成了一定程度的氧化损伤,也可能通过激活IL -17信号通路导致免疫炎症的发生㊂同时该藻还导致海水青鳉肝脏纤溶系统被激活,代谢功能发生变化㊂关键词:米氏凯伦藻;海水青鳉;影响效应;转录组分析;免疫
文章编号:1673-5897(2023)3-312-14㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
Transcriptome Analysis about Effect of Karenia mikimotoi on Oryzias melastigma
Yang Guiqin 1,Li Xiaodong 1,*,Lu Weijing 1,Li Jianxin 1,Li Jing 2,Chang Yang 1,Wang Ziyang 1,Zhang Weini 1,3,Chen Xinhua 1
1.Marine Research Institute,Fujian Agriculture and Forestry University,Fujian Key Laboratory of Marine Biotechnology,Fuzhou 350002,China
2.Fujian Key Laboratory on Conservation and Sustainable Utilization of Marine Biodiversity,Fuzhou Institute of Oceanography,Min -jiang University,Fuzhou 350108,China
3.University Key Laboratory for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicine and Animal Healthcare in Fujian Province,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China
Received 6August 2022㊀㊀accepted 7October 2022
第3期杨桂琴等:米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析313
㊀Abstract:In recent years,harmful algal blooms caused by Karenia mikimotoi have occurred frequently in coastal waters of China,and caused huge financial losses to local aquaculture industry.However,its effect on marine or-ganisms at molecular level is still unclear.In this work,transcriptome analysis was used to explore the effects of K. mikimotoi on mRNA transcription in gill and liver of model organism marine medaka(Oryzias melastigma).Re-sults showed that508and604differentially expressed genes(DEGs)were detected in gill and liver after96h treat-ment,in which184and390DEGs were up-regulated,while324and214DEGs were down-regulated,respectively. Gene ontology(GO)functional classification showed that DEGs in both gill and liver were mainly concentrated in biological process and molecular function.Further GO enrichment analysis showed that K.mikimotoi could signifi-cantly affect the activities of thrombin-activated receptors,receptor signal pathway and ion transmembrane transport in gill of O.melastigma,as well as oxygen transport and binding pathways in liver.Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)functional enrichment analysis showed that DEGs were significantly enriched in complement and coagulation cascade of immune system in both gill and liver,DEGs in gill were also enriched in IL-17immune signal molecule and cytokine interaction signal transduction pathway,while DEGs were also enriched in lipid and amino acid metabolic pathway in liver.In addition,immune factors like serpine1,hsp90b1and bcl2l1were signifi-cantly inhibited by K.mikimotoi in gill of O.melastigma,while coagulation factors,such as f2,f5and plg,were significantly up-regulated in liver.Results indicated that K.mikimotoi might cause a certain degree of oxidative damage to the gill of O.melastigma,which might be related to immune inflammation caused by activating IL-17 signal pathway.Results also indicated that K.mikimotoi could activate fibrinolytic system in liver and change its metabolic function.
Keywords:Karenia mikimotoi;Oryzias melastigma;influence effect;transcriptome analysis;immune
㊀㊀有害藻华(harmful algal blooms,HABs)是指因微藻等生物大量繁殖,导致水产品死亡,破坏生态系统功能,威胁人类健康和生命安全的一种环境异常生态现象[1-4],其频发与人类活动导致的海水富营养化㊁全球气候变化等问题相关[5-7]㊂米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻华是一种对海水养殖业危害严重的有害藻华,广泛分布于亚洲㊁欧洲㊁美洲与非洲的近岸海域[2]㊂该藻藻华同样是我国近岸主要有害藻华之一[8],自1998年在香港近岸暴发导致大量养殖鱼类死亡以来[9],常年在我国渤海㊁东海等多地暴发,经济损失以数十亿元计[10],其中仅2012年福建近岸因其导致的鲍鱼养殖业的损失就高达20.1亿元[11]㊂
高密度的米氏凯伦藻不仅能够导致养殖鱼类与贝类大量死亡,对其他海洋生物也有显著的不利影响[12],如降低甲壳类的运动能力[13]㊁抑制中华哲水蚤摄食[14]㊁导致海胆㊁海星[15]等多种生物死亡㊂该藻能破坏鱼类与贝类的鳃,使其出现明显的鳃上皮细胞水肿㊁充血㊁脱落和皱缩等组织病变现象[16-17],从而影响其呼吸和渗透压调节㊂米氏凯伦藻还能显著降低贝类淋巴细胞的黏着性与吞噬能力[18],抑制细胞增殖,使鱼类胚胎滞长㊁畸变[19],影响斑马鱼胆碱能和神经系统的正常发育[20],表现出明显的免疫毒性和细胞毒性㊂米氏凯伦藻对多种生物的抗氧化㊁生殖与内分泌系统也有显著的不利影响[18,20-22]㊂但该藻对海洋生物分子水平的影响效应及相应机制的探究存在缺失㊂
转录组测序(RNA-Seq)能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的所能转录出来的所有RNA的总和,以其高通量测序能力㊁高灵敏度㊁宽范围㊁用时短㊁高效率㊁高重复性和低成本特点而被广泛应用[23-24]㊂该技术同样被广泛应用于有害藻毒性效应与机制的研究中,如微囊藻毒素-LR (MC-LR)能通过TLR/MyD88介导的信号通路引发斑马鱼慢性炎症反应[25],并且通过补体和凝血级联途径导致草鱼免疫功能受损[26]㊂而海水青鳉(Oryzi-as melastigma)因其个体小㊁性别易区分㊁繁殖周期短㊁产卵率高,可在实验室条件下大规模饲养等优点,已成为我国海洋生态毒理学研究的模式生物[27-29]㊂Qiao等[30]通过海水青鳉的综合组学分析,发现MC-LR能够影响能量产生㊁蛋白质生物合成和脂质代谢途径,导致生殖障碍㊂故本文选取海水青鳉为研究对象,借助RNA-Seq和生物信息学分析方法,探究米氏凯伦藻对海水青鳉分子转录水平的影响㊂
314
㊀生态毒理学报第18卷
1㊀材料与方法(Materials and methods)
1.1㊀实验生物培养
米氏凯伦藻和对照用小球藻(Chlorella sp.)均由中国科学院海洋研究所藻种中心提供,福建农林大学海洋研究院重点实验室连续培养,所有藻类均使用f/2海水培养基[31]纯种培养,培养/实验环境为温度(19ʃ1)ħ,光照强度(2650ʃ100)lx,光暗比14hʒ10h㊂海水青鳉由闽江学院提供,循环水系统连续培养至5月龄成鱼,养殖期间水温22䰍28ħ,光暗比12hʒ12h㊂仔鱼到成鱼各阶段每天9:00和17:00分别投喂轮虫㊁卤虫和优质饲料2次,每周更换新鲜的循环海水㊂用于藻类培养和实验鱼养殖的海水购自福建省海水公司,藻类培养和实验用海水均经0.45뚛m混合纤维滤膜过滤后高温高压消毒后备用㊂
1.2㊀实验处理及样品采集
指数生长期的米氏凯伦藻在光学显微镜下记录藻密度,用无菌海水稀释至终密度2ˑ104cells齺mL-1到500mL玻璃烧杯中(实验体积400mL),对照组添加与实验组等生物量的小球藻,空白组添加与实验组等量的无菌海水[32]㊂大小均一,状态健康的海水青鳉成鱼提前移至实验环境适应24h后随机挑到各组中,每组3个平行,每平行10条鱼㊂通过调节曝气保持各组溶解氧水平相当㊂实验进行96h,每24h喂食并更换新鲜藻液与无菌海水㊂取样前24h停止喂食,0.02%MS-222溶液将海水青鳉麻醉后迅速完整分离鳃(GI)和肝脏(LI)组织于无酶冻存管中,液氮速冻后80ħ保存㊂
1.3㊀转录组测序与分析
Trizol(Invitrogen,美国)法提取组织Total RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,NanoDrop2000检测RNA浓度和纯度,RNA6000Nano Kit检测RNA完整性㊂反转录构建cDNA文库后用Illumina HiSeq2000进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)㊂测序原始样本(raw reads)使用软件Fastp质控后得到高质量的质控数据(clean reads)㊂使用软件TopHat2进行序列比对(来源:https://www.ncbi. /genome/?term=txid30732[orgn];参考基因来源:Oryzias_melastigma;参考基因组版本:GCF_ 002922805.1)获得匹配数据(mapped reads),RSeQC-2.3.6整体质量评估后使用拼接软件String Tie进行转录组组装㊂
利用软件RSEM定量分析基因和转录本的表达量,DESeq2分析鉴定样本间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)(差异条件: log
2
fold changesȡ1且false discovery rate(FDR)< 0.05),并用Benjamini and Hochberg(BH)方法对差异检验P-value进行多重检验矫正后构建DEGs基因集㊂
利用Gene ontology(GO)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)数据库进行功能分类㊂用Fisher精确检验方法,使用Goatools软件和KOBAS软件分别进行GO和KEGG富集分析㊂并进行BH多重检验,当校正的P<0.05㊁P<0.01视为显著㊂
1.4㊀实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)验证
㊀㊀从测序结果中筛选出12个差异表达基因(ser-pine1㊁hsp90b1㊁bmp10㊁plat㊁sugt1㊁bcl2l1㊁ddit㊁nr4a1㊁dusp1㊁f2㊁f5㊁tbxas1㊁plg)进行qPCR验证(引物序列见表1)㊂通过测序提取的Total RNA使用反转录试剂盒(Promega,美国)合成cDNA,经纯化㊁末端修复㊁连接接头后进行PCR扩增,得到cDNA文库,qPCR反应程序为95ħ预变性150s;95ħ15s, 60ħ20s,72ħ20s,40个循环㊂以18s为内参基因,采用2-꥿꥿C t[33]方法分析结果,使用SPSS软件进行统计学分析㊂
2㊀结果(Results)
2.1㊀RNA-Seq数据质量评估及序列比对分析
本实验构建了暴露96h后海水青鳉鳃和肝脏组织共12个样本的转录组文库,各样本的clean reads均在4389万条以上,质控数据的测序碱基Er-ror rate均<0.0241%,Q20碱基百分比在98.33%以上,Q30碱基百分比在95.07%以上,说明测序结果质量较好;其中,2种鱼组织对照组(GI_C1㊁GI_C2㊁LI_C1㊁LI_C2)㊁空白组(GI_B1㊁GI_B2㊁LI_B1㊁LI_ B2)和实验组(GI_T1㊁GI_T2㊁LI_T1㊁LI_T2)能成功比对到海水青鳉基因组的clean reads比例分别在92.37%䰍94.96%之间,说明参考基因组的选择合理;有85.47%䰍90.33%之间比例的clean reads能成功比对到CDS参考序列上,说明测序深度足以覆盖转录组;样本间相关性分析结果表明同组织组内的相关性系数均>0.8;在样本间PCA分析时(图1),同组织组内的样本都聚集于同一象限中,说明组内重复性较强,组间差异较大,可进行下一步分析㊂
第3期
杨桂琴等:米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析315
㊀表1㊀荧光定量PCR 引物序列
Table 1㊀Primer sequences for qPCR
基因名称引物序列(5 ~3 )登录号Gene name
Primer sequences (5 ~3 )Accession No.serpine1F:ACCTGAGCTGTTCGAGGTTG R:ACGTTATGTCGTTGGCTGGT XM_024278641.1hsp90b1F:AAGACTTGGGAAAGAGCCGG R:GCATTCAAGCCATCGAGCTG XM_024282530.2bmp10F:CTACCAGAGCCAAATCCCTCATT R:GATACTAATGCTGCGTTCACGTC XM_024274754.2plat F:TCCTTTGACACTCCCTTACTGTG R:GTAGCACTGAGACACATAGCAGT XM_036213663.1sugt1F:CCATTATCTGCAAGTGAGCATGG R:CCTTTTAGATAGATGGCGCTTGC XM_024274231.2
bcl2l1F:CCTTTTAGTGTCGATCCTCCTCC R:CCTTCAAAAACAGAACACCTCCC ddit F:ATGACCTCTTCTTCGATCCGATG R:GTCCGAGTCTTTGGCTTCTCTAA XM_024293029.1XM_024285260.2nr4a1F:GGATCTTTTGATGCGTACTCGTG R:TAACTCAGAGTGAACGTTCCAGG XM_024294112.1dusp1F:CGCGCTTATCAACGTGTCTG R:TAGTTGTCCTCGACGGGGAT XM_024283500.2f2F:AAGATGACATCCTGGTCCGC R:TCGTCGCTGAAGATGATGGG XM_024289097.2f5F:TTCACCTGGTGGGAATGAGC R:TGTAAGGAGCCACCAAGCTG XM_024286186.2tbxas1F:ATTCAGGTTCGCTAGAGAAGTGG R:GTGAACCTCTCAGGGATGAACTT XM_024282463.2plg F:CGGCCCTCTAGTGTGTTTGT R:TAGCCGGCTTTCATGGTTGT XM_024264055.218s
F:CCTGCGGCTTAATTTGACCC R:GACAAATCGCTCCACCAACT
参考基因[34]Reference gene
[34]
图1㊀样本间PCA 分析
注:(a)鳃;(b)肝脏㊂
Fig.1㊀PCA analysis between samples
Note:(a)Gill;(b)Liver.
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㊀生态毒理学报第18卷
2.2㊀差异表达基因(DEGs)
如图2(a)所示,海水青鳉肝脏实验组与对照组
相比,共有604个差异基因,390个上调基因,214个
下调基因;空白组与对照组相比,共有10662个差异基因,4766个上调基因,5896个下调基因㊂鳃实验组与对照组相比,共有508个差异基因,184
个上
图2　表达量差异分析
注:(a)各处理组差异表达基因(DEGs)统计;(b)鳃对照组与实验组DEGs 火山分布图;(c)肝脏对照组与实验组DEGs 火山分布图;
(d)鳃空白组与实验组DEGs 火山分布图;(e)肝脏空白组与实验组DEGs 火山分布图㊂
Fig.2㊀Expression difference analysis
Note:(a)Differentially expressed genes (DEGs)statistics of each treatment group;(b)DEGs volcanic distribution among gill control and experimental group;(c)DEGs volcanic distribution among liver control and experimental group;(d)DEGs volcanic distribution among gill blank and experimental
group;(e)DEGs volcanic distribution among liver blank and experimental group.
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㊀调基因,324个下调基因;空白组与对照组相比,共有6060个差异基因,3454个上调基因,2606个下调基因㊂不同组间DEGs 上下调的分布情况如图2(b)㊁2(c)㊁2(d)㊁2(e)㊂
2.3㊀DEGs 的GO 功能分类和富集分析如图3所示,在GO 功能注释中,DEGs 可分为
分子功能(molecular function,MF)㊁生物过程(biologi -cal process,BP)和细胞组成(cellular component,CC)三大类㊂鳃对照与实验组相比,508个DEGs 中209个GO terms 得以注释,78个GO terms 存在显著富集(P 올0.01),其中包括53个BP 类,21个分子功能(molecular function,MF)类和4个CC 类㊂肝脏对照与实验组相比604个DEGs 中279个GO terms 得以注释,123个GO terms 存在显著富集(P 올0.01),其中包括89个BP 类,27个MF 类,7个
CC 类㊂在图3中2种鱼组织存在显著富集的20个GO terms 在CC 类中共同影响最大的是细胞膜部分(membrane part)和细胞部分(cell part);在MF 类中共同影响最大的是催化活性(catalytic activity)和结合(binding);而在BP 类中,共同影响较大的是细胞进程(cellular process),其中鳃还显著影响生物调节(biological regulation),肝脏显著影响的是代谢进程(metabolic process)㊂此外,DEGs 的GO 在肝脏中还显著富集于氧运输(oxygen transport)㊁氧结合(oxygen binding)和氧载体活性(oxygen carrier ac -tivity);鳃在凝血酶激活受体信号通路(thrombin -ac -tivated receptor signaling pathway)㊁凝血酶激活的受体活性(thrombin -activated receptor activity)和离子跨膜运输(anion transmembrane transport)也存在显著富集
㊂
图3㊀各基因集DEGs 分布情况
注:(a)鳃对照组与实验组;(b)鳃空白组与实验组;(c)肝脏对照组与实验组;(d)肝脏空白组与实验组㊂
Fig.3㊀Distribution of DEGs in each gene set
Note:(a)Gill control and experimental group;(b)Gill blank and experimental group;(c)Liver control and experimental group;(d)Liver blank and experimental group.
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㊀生态毒理学报第18卷
2.4㊀DEGs 的KEGG 信号通路及富集分析
在鳃对照组与实验组的所有DEGs 进行KEGG
富集分析发现有374个信号通路得以注释,其中24个信号通路存在显著富集(P 올0.05),且7个均与免疫系统和信号分子转导通路有关(图4(a)),同样在图4(b)对照组与实验组中也发现此信号通路,包括补体和凝血级联反应(complement and coagulation cas -cades)㊁白介素-17(IL -17signaling pathway)㊁白细胞跨内皮迁移(leukocyte transendothelial migration)㊁细胞因子相互作用(cytokine -cytokine receptor interac -tion)㊁病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用(viral protein interaction with cytokine and cyto -kine receptor)㊁低氧诱导因子信号通路(HIF -1signa -ling pathway)和肿瘤坏死因子(TNF signaling path -way)信号通路㊂在肝脏中,有475个信号通路得以注释,其中45个信号通路存在显著富集(P 올0.05),受到影响更强的是免疫系统的补体和凝血级联反应
(complement and coagulation cascades)和代谢相关的通路(图4(c)㊁4(d))㊂同时,为了更全面了解米氏凯伦藻对海水青鳉的免疫毒性效应,本研究获得了免疫系统与信号分子转导信号通路的DEGs 信息,并对部分DEGs 进行了验证㊂
2.5㊀荧光定量PCR 验证RNA -Seq 数据通过qPCR 验证部分DEGs 显示(图5),米氏凯
伦藻刺激海水青鳉96h 后,鳃中serpine1㊁hsp90b1㊁
bmp10㊁plat ㊁sugt1㊁bcl2l1㊁ddit ㊁dusp1基因表达水平显著下调,肝脏中f2㊁f5㊁tbxas1㊁plg 基因表达水平显著上调,这些基因的表达量变化和RNA -Seq 数据表达变化一致㊂3㊀讨论(Discussion )
米氏凯伦藻是一种典型的鱼毒性赤潮藻肇事种,有研究表明其藻华降解时产生的缺氧环境与氨氮不是造成鱼贝类大量死亡的主要原因[35-36];
该藻
图4㊀KEGG 富集分析
注:(a)鳃对照组与实验组;(b)鳃空白组与实验组;(c)肝脏对照组与实验组;(d)肝脏空白组与实验组㊂
Fig.4㊀KEGG enrichment analysis
Note:(a)Gill control and experimental group;(b)Gill blank and experimental group;(c)Liver control and experimental group;(d)Liver blank and experimental group.
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㊀
图5㊀荧光定量PCR 验证部分DEGs Fig.5㊀qPCR validation of partial DEGs
脂溶性提取物具有较强的溶血毒性和细胞毒性,但该提取物较高浓度下也不能显著降低褶皱臂尾轮虫和皱纹盘鲍的存活率[2,12];只有完整存活的藻细胞近距离接触海洋生物时,才会对其产生明显的毒性作用[2]㊂因此,本实验将与米氏凯伦藻直接接触的鳃组织和解毒相关重要器官肝脏作为研究对象进行
转录组测序,结果表明该藻对其基因转录水平有着显著的影响,2种组织受藻影响存在一定的差异㊂KEGG 富集结果表明DEGs 在鳃中主要集中于免疫系统和和信号分子转导相关通路,比如补体和凝血级联反应㊁IL -17信号通路㊁白细胞跨内皮迁移㊁细胞因子相互作用㊁低氧诱导因子和肿瘤坏死因子信号通路,在Zhang 等[16]研究中同样发现,米氏凯伦藻能激活海水青鳉鳃的免疫反应并增强其信号分子转导通路;而肝脏则显著富集于内分泌系统㊁脂质和氨基酸代谢相关通路㊂这可能是因为鳃参与气体交换㊁进行渗透压和酸碱调节,其不但是鱼类最主要的呼吸器官,更是接触水中有毒物质最直接的器官[37],这才使得米氏凯伦藻能够直接导致鳃应激;而肝脏在脊椎和水生动物蛋白质合成㊁脂肪代谢㊁能量生成和药物解毒发挥着极其重要的功能,两者功能的不同导致受藻影响的主要通路也存在一定的区别㊂与此同时,鱼鳃受藻影响导致的呼吸功能与免疫功能可能同样对肝脏的代谢产生一定的影响㊂
米氏凯伦藻对青鳉鳃和肝脏中凝血和补体级联反应相关通路都有显著影响,这和MC -LR 处理草鱼中显著富集凝血与补体级联反应的免疫差异基因较多的结果为相似[26]㊂凝血系统可将入侵的微生物凝结在血液凝块中,以增加血管的渗透性和作为吞噬细胞的趋化剂而促进天然免疫系统防御[38];而补体系统在先天免疫和获得性免疫发挥着重要作用,
是一种抗微生物防御,免疫调节及介导免疫病理的损伤性反应[39-40]㊂凝血过程可分为凝血酶原激活物㊁凝血酶和纤维蛋白的形成3个阶段,而凝血酶激活物可由2种不同的途径激活:一是由组织损伤而引起的外源性途径,二是与血管损伤相联系的内源性途径㊂在本研究中(图6),由鳃释放的因子Ⅲ(F3)进入血液与有活性的因子Ⅷa(F7a)结合启动凝血过程,这表明米氏凯伦藻对海水青鳉鳃造成了一定的组织损伤,从而激活外源性途径㊂肝脏中的活化型因子Xa(F10a)与凝血因子V(F5)共同作用,形成活化的凝血酶Ⅱa(F2a),引起纤维蛋白原的降解,启动纤溶系统(图7)㊂纤溶系统在维持血液流动性和血管完整性方面起着重要作用㊂其包括纤溶酶原(plasminogen,Plg)的激活和纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)的降解[41]㊂Plg 的激活是纤溶反应的关键,在血液凝固过程中会激活细胞粘附㊁迁移㊁增殖通路㊂在肝脏实验组中(图7),凝血酶F2和Fg 明显被激活,Plg 的转录水平也显著上调,纤维蛋白形成血凝块,这说明米氏凯伦藻可能导致海水青鳉组织溶血,而被激活的肝脏凝血级联反应,能防止机体过量溶血并阻止病原体的入侵㊂
补体系统可通过3种不同的方式激活:一是经典途径(CP);二是旁路途径(AP);三是凝集素途径(MP)㊂由图6可知,在本实验中主要受到影响的是AP ,水解的C3受到因子FH 和FI 复合物的抑制作用形成C3转化酶,继而激活了C3,引发了酶促级联反应㊂在膜攻击阶段时,C5转化酶裂解C5产生具有过敏毒素和趋化活性的C5a 及易吸附于邻近的细胞表面的C5b ,C5b 与下调的C6㊁C7㊁C8㊁C9结合形成膜攻击复合物,深入穿透病原体膜,引起细胞膜损伤[42]㊂补体C3在补体系统中含量最高,在补体
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㊀生态毒理学报第18卷
系统激活中也起关键作用,而本研究中鳃能明显激活C3,引发细胞溶解,这可能是由于米氏凯伦藻对
海水青鳉造成的鳃外源性组织损伤而引起鳃细胞固缩㊁溶解,进而可能使细胞坏死及凋亡
㊂
图6㊀鳃补体和凝血级联反应
注:(a)鳃对照组与实验组;(b)鳃空白组与实验组;蓝色方框代表基因/转录本下调;红色方框代表基因/转录本上调㊂
Fig.6㊀Complement and coagulation cascade in gill
Note:(a)Gill control and experimental group;(b)Gill blank and experimental group;
blue box represents gene/transcript down -regulation;red box represents gene/transcript up -regulation.
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㊀
图7㊀肝脏补体和凝血级联反应
注:(a)肝脏对照组与实验组;(b)肝脏空白组与实验组;蓝色方框代表基因/转录本下调;红色方框代表基因/转录本上调㊂
Fig.7㊀Complement and coagulation cascade in liver
Note:(a)Liver control and experimental group;(b)Liver blank and experimental group;blue box represents gene/transcript down -regulation;red box represents gene/transcript up -regulation.
㊀㊀米氏凯伦藻对鳃IL -17相关通路有着显著的影
响,其下游相关信号通路包括细胞因子相互作用㊁核
因子NF -姕B 和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路均可调控细胞核内DNA 转录,诱导趋化因子
(CXCL1㊁CXCL2㊁CXCL8㊁CXCL10㊁CCL20)㊁细胞因子(IL -6㊁TNF -잺㊁COX2㊁G -CSF )㊁抗微生物肽(De -
fensins ㊁MUC5AC ㊁MUC5B )㊁基质金属蛋白酶(MMP1㊁MMP2㊁MMP9㊁MMP13)和标志性IL -17炎症因子的表达产生,而以上基因的表达可能会导致机体自身免疫疾病㊁中性粒细胞浸润㊁炎症反应和细胞免疫病原体的形成(图8)㊂
米氏凯伦藻对鳃IL -17相关通路的影响还导致了其下游MAPK 信号通路被激活㊂这与MC -LR 通过抑制蛋白磷酸酶PP2A 导致MAPK 相关通路被激活的结果较为相似[43-44],MAPK 被激活后会调节原癌基因的表达,已知靶点包括原癌基因fosab 和junba [45-46],这2个基因参与调控与生长㊁分化和细胞增殖的基因转录[44-45]㊂本研究中受藻影响的MAPK 信号通路激活后下调了原癌基因fos ㊁fosb ㊁
jund 的转录水平,也影响了肿瘤坏死因子信号通路(图8),这表明米氏凯伦藻可能会诱导海水青鳉肿瘤相关疾病的产生㊂
同时在鳃IL -17信号通路中也观察到热休克蛋白hsp90的显著下降(图8)㊂热休克蛋白,已被推荐作为环境压力的生化指标,它可以通过防止重要蛋白质的不可逆损失并促进其随后的再生来保护细胞免受氧化应激[47],hsp70还与先天免疫和适应性免疫有关[48]㊂在肝脏中也发现氧化还原酶及其过程的显著标记,这或许表明米氏凯伦藻对海水青鳉鳃和肝脏造成了一定程度的氧化损伤,这与相较于海洋卡盾藻对贝类的影响集中于氧化应激通路较为相似[49]㊂与此同时,米氏凯伦藻对海水青鳉的影响还显著富集到低氧诱导因子信号通路(图4(a)),说明米氏凯伦藻将可能会导致海水青鳉缺氧现象产生
㊂
图8㊀鳃IL-17相关通路
注:蓝色方框代表基因/转录本下调;红色方框代表基因/转录本上调㊂
Fig.8㊀Gill IL -17related pathway
Note:Blue box represents gene/transcript down -regulation;red box represents gene/transcript up -regulation.
㊀㊀离子跨膜运输对细胞的生存和生长至关重要,离子平衡维持着体液的稳态[50],而Na +-K +-ATP 酶在离子平衡和渗透压调节中起着关键作用,其能为
Na +-K +跨膜主动转运提供能量,在鱼鳃中酶活力也
最高[51]㊂同时米氏凯伦藻能在短时间内显著抑制轮虫Na +-K +-ATP 酶活性[21],降低海水青鳉Na +-K +-
ATP酶相关基因转录表达水平[16],从而影响生物渗透压调节功能㊂同样在本研究GO富集发现,米氏凯伦藻能显著影响海水青鳉鳃的离子跨膜运输功能,这表明米氏凯伦藻可能导致鳃渗透压失调,细胞破裂,这和之前文献的结果能够对应[12,52]㊂
实验结果同样表明米氏凯伦藻对海水青鳉的节律调节有一定的影响㊂昼夜节律调节在睡眠㊁摄食㊁生殖和细胞代谢等多种生理功能中发挥着重要作用,生物钟不仅存在于中枢神经系统,也存在于外周器官和组织[53]㊂昼夜节律分子机制主要由4个核心蛋白组成,首先是昼夜运动输出蛋白Clock和转录调控时钟控制蛋白BMal1,同时激活周期Per和隐色素Cry蛋白的转录,从而通过抑制Clock:BMal1介导的转录而产生负反馈循环[54]㊂同时在斑马鱼中发现了编码这4种蛋白质的基因在外周组织能进行有效表达[55]㊂海水青鳉的繁殖特性也受光周期调节的影响,其基因per1和per3也发生了显著上调,而昼夜节律调节相关基因的扰动是否会影响海水青鳉的生殖功能和代谢途径还有待进一步验证㊂
通信作者简介:李晓东(1992 ),男,博士,副教授,主要研究方向为生态毒理学㊂
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