基因工程复习资料

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

第一章DNA的分子特性与利用
1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别?
1)原核基因表达调控的三个水平:转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。

2)真核生物基因表达的特点:
●1.基因组DNA存在的形式与原核生物不同;
●2.真核生物中转录和翻译分开进行;
●3.基因表达具有细胞特异性或组织特异性;
●4.真核基因表达的调控在多个水平上进行:DNA水平的调控、转录水平调控、转
录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控;
第二章基因工程操作的基本技术
1.DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。

在碱性环境下,核酸分子带负电荷,在外加电场的作用下,分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动,其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。

2.DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些?
1)分子本身的影响
⌝分子的大小:小则快
⌝带电荷数:多则快
⌝分子构型:超螺旋>解螺旋
2)电场:直流电场
⌝电压高则快
⌝电压太高则结果不准确
常用3~5V/CM
3)支持物介质
⌝种类:琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
⌝凝胶浓度: 浓度大,筛孔小,适合小分子电泳;浓度小,筛孔大,适合大分子电泳4)电泳缓冲液
⇐ pH值:偏碱性,带负电荷
⇐离子浓度:离子浓度高⎽电流大⎽发热快⎽胶溶解
⇐种类:TAE、TBE、TPE、TNE
3.PCR的原理和主要反应过程,并分析影响PCR扩增的影响因素。

PCR原理:变性温度下,DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA,在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合,然后在DNA聚合酶的作用下,在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链,实现DNA的扩增。

影响PCR扩增的影响因素:
§(1)Taq酶:常用1U/25µL
≥浓度低,扩增产物不够;
≥浓度高,非特异性扩增增加;
≥酶的活性;
§(2)dNTP的浓度:常用100-200µmol/L,不能低于20µmol/L,特异性、保真性;
§(3)模板:主要考虑纯度及使用量,对纯度要求不高,但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。

使用量从几个ng到100ng.
§(4)引物浓度:0.1-0.5µmol/L之间,过多则非特异扩增增加,形成引物二聚体;
§(5)Mg2+浓度:常用0.5-2.5mmol/L;
影响:酶的活性、引物-模板退火、特异性
§(6)PCR反应程序设定:变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数
4.PCR引物设计的原则,若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列,如何设计
扩增引物?(关于如何设计这个问题,靠自己了)
引物设计原则:
1、G+C含量45-55%;
2、Tm值高于55;
3、引物特异性;
4、引物扩增跨度;
5、是否形成引物二聚体
5.定量PCR的原理?Ct值的含义。

原理:通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号,来实现对起始模板进行定量及定性的分析。

初始模板量X0的对数值与C(T) 值之间呈线性关系:log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N
Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数(如后图所示,图仅供参考)
1、限制性核酸内切酶的类型,基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶?(常用II型)
2、结合已做的实验,分析影响酶切的因素。

(这个答案是上届的,仅供参考)
1)DNA的纯度:DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。

2)DNA的甲基化程度:dam甲基化酶(修饰GA TC中的A);dcm甲基化酶(修饰CCA/TGG 的C)。

3)温度:不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。

大多数是37 o C,少数要求40-65 o C。

4)缓冲液(Buffer):是影响限制酶活性的重要因素。

1、同裂酶和同尾酶:同裂酶:不同的酶识别序列相同,切割位点可以相同也可以不同的酶。

同尾酶:不同限制酶识别序可以相同,也可以不同,但它们产生的末端是一样的,末端间
可以相互连接。

4、多克隆位点(MCS):多克隆位点,指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA区段,以方便载体与外源片段的重组。

6. 星星活性:在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称星星活性。

星活性就是酶切条件不合适导致酶的错误切割。

7. 限制修饰系统:限制修饰系统是大多数细菌体内存在的类似动物免疫系统的同限制性内切酶和甲基化酶组成的保护系统。

即通过限制性内切酶破坏噬菌体的DNA而导致噬菌体的寄主范围受到限制,同时通过甲基化酶的作用,将细菌自身的DNA甲基化,使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。

8. 插入失活(Insert inaction)基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点,在该位点用相应的限制性内切酶处理,并将外源DNA片段插入该位点,则插入的外源DNA片段将破坏原有基因的读码框,往往导致原有的选择标记基因无法翻译表达,或即使翻译表达,形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质,这一现象称为插入失活。

9. 转基因动物:是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内,使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达,且能稳定地遗传给后代的动物。

10. 考斯质粒:cosmid,是经过人工构建的一种外源DNA载体,保留噬菌体两端的COS区,与质粒连接构成。

11.质粒不亲和性:在没有选择压力的情况下,两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。

12.cDNA文库:是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。

13.T-A clonging: 又名PCR克隆。

TaqDNA聚合酶具末端转移酶活性,故用TaqDNA聚合酶进行PCR反应,反应产物在其3’末端往往习惯性的带上一个腺嘌呤粘性末端(-A),从而难以将该产物以平末端连接的方式直接克隆到载体上;针对PCR产物的这一特点,将普通的质粒载体在其多克隆位点上用一种限制性内切酶处理,获得线形的平末端载体,再在该载体的基础上用末端转移酶给其3’末端加上一个胸腺嘧啶粘性末端(-T),由此获得的新型载体称之为T载体;用T载体的3 ’T与含PCR产物的3’A进行配对,而将PCR产物以粘末端连接的方式直接高效的克隆到T载体上的过程称之为T-A cloning。

14. 双特异性抗体 :两抗体的重链和轻链基因的重组体导入宿主细胞中表达,或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因,构建单肽双特异性抗体。

一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体。

15.穿梭质粒载体:指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记,因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

16. DNA 芯片:是将许多特定的DNA寡聚核苷酸或DNA片段(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内,将待测样本标记后同芯片进行杂交,利用碱基互补配对原理进行杂交,通过杂交信号的计算机检测分析判断目的片段的存在与否,存在量的多寡,以用于基因的功能研究和基因组的研究,疾病的临床诊断和检测等众多方面。

17.reporter gene报告基因,是指一种编码能被检测的蛋白质或酶的基因,即其编码产物很容易被检测到。

作为报告基因,其必须是已被克隆与全序列的,且在宿主细胞内与被转染的细胞内无背景,还要求其产物能够被定量测定,常用的如His。

19. 基因敲除 (knock-out)将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。

常用同源重组的方法敲除目的基因,观察生物或细胞的表型变化,是研究基因功能的重要手段。

20. T-DNA:是农杆菌侵染植物细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。

该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。

21. 融合蛋白: 通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组,将其表达后获得的新蛋白质。

22. 位点偏爱 (Site preference) :某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割,即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。

23. 基因组文库:一种生物整个基因组随机产生的若干DNA片段的克隆群。

某种生物全部基因组DNA序列的随机片段重组DNA克隆的群体。

该文库以DNA片段的形式贮存着某种生物全部基因组的信息,可以用来选取任何一段感兴趣的序列进行复制和研究。

24.克隆载体:可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。

该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记,常用于外源基因的克隆,如噬菌体或质粒。

25.表达载体:能使插入基因进入宿主细胞表达的克隆载体,包括原核表达载体和真核表达载体,可以是质粒、噬菌体或病毒等。

典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列,并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点。

表达载体包括四部分:目的基因、启动子、终止子、标记基因。

表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、核糖体结合位点RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体。

相关文档
最新文档