大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
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镊仔细剥离软脑膜和血丝，剥离干净后用PBS 液洗2-3遍。
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
ppt课件
9
实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
ppt课件
酒精
PBS
断头
清洗血液
10
实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
ppt课件
16
影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
ppt课件
17
影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
ppt课件
1
☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
准备工作
实验步骤
影响因素
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么 都差，高度一致。 4 neurobasal和neurbasal-A被认为是最标准，最好的培养 基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。
ppt课件
18
影响因素
培养板选择
6孔板是最佳选择
大于6孔板（比如6CM DISH） 会使得中间很难和周围的细胞 密度一样，造成板中间和边缘 成熟度不一样，而这会给实验 带来很大干扰。
ppt课件
5
实验准备
仪器、材料与试剂
实验仪器
材料与 试剂
无菌操作台，培养箱 培养板，青霉素瓶，离心机，计数板 冰盒，滤器（200目自制），手术器械
新生鼠 DMEM F12培养基（ 20% 血清）， 025%胰酶 多聚赖氨酸，碘酒， 75% 酒精，PBS，阿糖胞苷
ppt课件
6
实验准备
实验前准备工作
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
实验原理
◆细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之 一。可分为原代培养和传代培养两种。 ◆原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取
出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适 的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
96孔或128孔：细胞会倾向于 向中间集中也会照成发育不均 匀
ppt课件
19
影响因素
重点
剥膜
吹打时候难，造成神经元死亡
血管膜细胞会混入原代培养 中，培养成果根本不能用
ppt课件
20
影响因素
重点
消化习惯
消
化 速
消化
酶的选择
度
消化过程中震荡
ppt课件
胰酶 木瓜酶 DNA酶
21
谢谢！
ppt课件
22
培养板包被
制备冰盒
0.1 %多聚赖氨酸包被
ppt课件
培养基，阿糖 胞苷配制
7
实验步骤
要点
细节决定成败
细心
耐心
ppt课件
8
实验步骤
胰酶消化法
1 准备：
取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外 线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精 擦拭手及台面。
2 布局：
点燃酒精灯，安装吸管帽；准备离心管； 平皿及器 械放置妥当。
10 种 板：
以5×105 个/ml接种于用多聚左旋赖氨酸包被 过的培养板内，培养板置细胞培养箱中37℃、
5%CO2、饱和湿度下进行培养
ppt课件
14
实验步骤
5 纯化：
培养48小时全量换液，加入终浓10μmol/l 阿糖胞苷的培养液。 目的：抑制质细胞等非神经元细胞的生长。
ppt课件
15
影响因素
ppt课件
12
实验步骤
7 终止消化： 用含20%血清的DMEM-F12培养液终止消化，
轻轻用吸管吹打均匀， 离心1000 rpm 10min。
8 过筛网： 弃去上清液，加入20%血清的DMEM-F12培养
液，轻轻用吸管吹打均匀，200目尼龙网过滤。
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13
实验步骤
9 细胞计数：
4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×n(稀释倍数) 4
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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9
实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
10
实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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16
影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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1
☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
准备工作
实验步骤
影响因素
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么 都差，高度一致。 4 neurobasal和neurbasal-A被认为是最标准，最好的培养 基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。
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18
影响因素
培养板选择
6孔板是最佳选择
大于6孔板（比如6CM DISH） 会使得中间很难和周围的细胞 密度一样，造成板中间和边缘 成熟度不一样，而这会给实验 带来很大干扰。
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5
实验准备
仪器、材料与试剂
实验仪器
材料与 试剂
无菌操作台，培养箱 培养板，青霉素瓶，离心机，计数板 冰盒，滤器（200目自制），手术器械
新生鼠 DMEM F12培养基（ 20% 血清）， 025%胰酶 多聚赖氨酸，碘酒， 75% 酒精，PBS，阿糖胞苷
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6
实验准备
实验前准备工作
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
实验原理
◆细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之 一。可分为原代培养和传代培养两种。 ◆原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取
出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适 的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
96孔或128孔：细胞会倾向于 向中间集中也会照成发育不均 匀
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19
影响因素
重点
剥膜
吹打时候难，造成神经元死亡
血管膜细胞会混入原代培养 中，培养成果根本不能用
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20
影响因素
重点
消化习惯
消
化 速
消化
酶的选择
度
消化过程中震荡
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胰酶 木瓜酶 DNA酶
21
谢谢！
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22
培养板包被
制备冰盒
0.1 %多聚赖氨酸包被
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培养基，阿糖 胞苷配制
7
实验步骤
要点
细节决定成败
细心
耐心
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8
实验步骤
胰酶消化法
1 准备：
取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外 线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精 擦拭手及台面。
2 布局：
点燃酒精灯，安装吸管帽；准备离心管； 平皿及器 械放置妥当。
10 种 板：
以5×105 个/ml接种于用多聚左旋赖氨酸包被 过的培养板内，培养板置细胞培养箱中37℃、
5%CO2、饱和湿度下进行培养
ppt课件
14
实验步骤
5 纯化：
培养48小时全量换液，加入终浓10μmol/l 阿糖胞苷的培养液。 目的：抑制质细胞等非神经元细胞的生长。
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15
影响因素
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12
实验步骤
7 终止消化： 用含20%血清的DMEM-F12培养液终止消化，
轻轻用吸管吹打均匀， 离心1000 rpm 10min。
8 过筛网： 弃去上清液，加入20%血清的DMEM-F12培养
液，轻轻用吸管吹打均匀，200目尼龙网过滤。
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13
实验步骤
9 细胞计数：
4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×n(稀释倍数) 4