大型真菌分离与保存技术

大型真菌分离与保存技术
这里的大型真菌主要是指蕈菌，通常说的食用菌这块或蘑菇。

(一)、菌种分离及保藏
菌种分离是对真菌菌丝的纯化过程，是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。

蘑菇菌种的分离方法有三种：即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。

1. 孢子分离法
蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。

孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。

（1）采集孢子
采集孢子首先要选好的子实体。

一般选用个体健壮，特征典型的子实体，将选好的子实体采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。

随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩。

这套孢子收集装置需事先进行高压灭菌消毒。

把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20°C的室内,经24-48小时左右，可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。

在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。

在野外时，可用火烧红消毒的刀切割一小块组织，用硅酮粘在培养皿盖子内面上让孢子弹射到培养基上。

2. 孢子分离
多孢分离法：即把多个孢子接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易。

（１）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24°C恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约15-20天），挑选萌发快，长势旺的菌落，转接于新试管培养基上再行培养。

（２）涂布分离法：按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴1-2滴到PDA试管或培养皿培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。

孢子在培养基上经24°C恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称，生长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即为母种。

单孢分离：就是将采集到的孢子群单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯种的方法，单孢子分离的方法，按分离的手段可分为以下三种。

（１）稀释分离法：这是通过不断稀释孢子悬浮液，使孢子分散最终孢子浓度控制在300-500个孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入平板均匀涂布，分散孢子各自萌发形成单孢菌落，其步骤如下：
制备无菌水试管:取10支试管,其中1支装100毫升蒸馏水,其它9支装9毫升蒸馏水,经高压灭菌即成无菌水。

制孢子悬液：取一小块收集有孢子的滤纸条，浸入10毫升无菌水试管中, 摇振使孢子分散成悬液,用无菌1毫升移液管吸取1毫升孢子悬液于第2支试管中, 摇振使其分期,再从第2支试管中吸取1毫升注入第3支试管中, 如此反复稀释直到孢子浓度达到300-500个孢子/毫升,备用。

制培养基平板：配制PDA培养基,装入三角瓶中进行高压灭菌, 准备倒平板的培养皿也经过高压灭菌备用,待已灭菌的PDA冷却至50-60°C时,在无菌操作下倒15-20 毫升PDA至培养皿中,培养皿放平,昼使培养基表面光滑,厚度一致。

孢子涂布：在无菌操作下，吸取0.1毫升的孢子悬浮液滴在平板培养基表面上,使用T氏棒把孢子均匀涂布在平板上,盖上刺激菌丝培养皿,放置于24-25°C 恒温箱中培养。

挑选单孢子萌发菌落：一般孢子经过５天的培养开始萌发长出菌丝，培养皿经过
显微镜的镜检确定孢子萌发的菌落是由单个孢子萌发成长而成的，可使用打孔器进行打孔把该菌落移接至新鲜的PDA斜面试管中继续培养。

打孔器的外径应小于显微镜的视野范围，而且打孔之前须检查该菌落周围是否有孢子或其它菌落，昼使打孔不会触及周边的孢子或菌落，确保纯种。

（２）毛细管法：孢子悬浮液经过稀释，使用毛细滴管把孢子悬浮液滴一小滴于皿盖内，昼使每一滴只含有一个孢子，从而达到单孢子分离，其方法如下：孢子悬浮液制备同稀释分离法，孢子浓度控制在200-300个孢子/毫升。

毛细滴管制备:取洁净的玻璃管在酒精喷灯上先拉成外径1毫米的细管, 稍冷却后再加热并迅速拉长,使管尖内径约200微米,剪断即成毛细滴管,在滴管后端塞棉花, 装入消毒盒中后进行灭菌备用。

点样镜检：用毛细滴管吸取经稀释的孢子悬浮液约0.1毫升(可滴30滴),在无菌操作下,快速点于皿盖内壁的标记圈中央,滴液应小于低倍镜的视野, 点样后的培养皿仍盖在有水琼脂的皿底上,贴胶布固定后再用低倍锐检查皿盖内壁的的液滴,确定是单孢者,即在皿盖上标上记号。

培养基推贴及刺激培养：使用接种针取一小块PDA培养基(约2×2毫米方块) 推贴至标记为单孢子的液滴,使液滴中的孢子能够吸附到培养基边缘。

将事先培养好蘑菇气生菌丝的平板培养皿盖取下，套在菌丝平板的底部，再把已分离并推贴好的培养基的皿盖罩在套有菌丝平板的玻璃皿上，使两个皿盖对接，贴胶布封口(要留0.5厘米缝用作通气),这样就形成一个刺激单孢子萌发的培养室,置培养箱中24 °C下培养,待单孢子萌发,及时撕下胶布,用接种铲挑取已萌发的单孢菌丝贴块,移接到新鲜PDA斜面试管中,置24°C恒温箱中培养,即可区得单孢纯种。

（３）器械分离法：应用显微操作器，直接挑选单孢子，移至PDA 平板中进行孢子刺激萌发培养,获得单孢纯种。

孢子悬浮液制备：同稀释分离法，孢子浓度控制在1000个/毫升;
平板涂布:将稀释后的孢子悬浮液滴0.1毫升于平板上，用无菌的T氏棒进行均匀涂布,每个平板含孢子大约100个左右;
镜检分离:待涂布均匀的平板琼脂表面水分干燥后即可于显微镜下观察,当在视野中心见到孢子,而视野周围无其它孢子时,可用显微操作器操纵玻璃针把
孢子从培养基表面挑取,随后把孢子转移至PDA平板的表面上,进行孢子萌发培养,孢子萌发培养须使用蘑菇气生菌丝刺激培养,才能提高萌发率,培养的具体操作方法与涂布分离法相同。

（４）单孢子菌落移接：当孢子经过10天的刺激培养, 肉眼可见到菌丝生长而成小菌落,应及时用打孢子器把该菌落分离,每天都应观察孢子萌发情况, 如果不及时把菌落移接,该菌落会快速生长而影响较迟萌发单孢子的分离。

2. 组织分离法
组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。

组织分离系一种无性繁殖法，双亲的染色体没有经过重组，因此组织分离基本上可保持亲本的生物学特性，操作简便，取材广泛，在进行野生菌株分离时，比较常用。

其方法如下：挑选子实体：其标准与孢子收集要求相同；
菇体消毒：将子实体菌柄基部切除,置接种箱内,用75%酒精对菇体表面进行消毒;
组织分离:解剖刀经火焰灭菌,在菇柄中部纵切一刀, 用手掰开菌再用接种铲在菇盖与菇柄交界处切五个小方块,随后挑取一小块组织,迅速移接到PDA斜面培养基上,置24°C下培养,待组织块长出菌丝无污染即为纯种。

3. 菌种保藏：取下述的预培养液，加到消毒后的带盖小瓶中1毫升（2-3份），干冰冷冻，-70°C贮存，再转移致液氮中保存。

菌种保存一定时间后，要复活，进行重培养，再保存。

也可将5毫升预培养液加到已加入5毫升甘油的试管中，-18°C保存。