免疫组化的原理及流程介绍

免疫组化原理及流程介绍
(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反响结果简洁受到 内源性过氧化物酶的干扰，必需用 过氧化氢等进展灭活。
免疫组化原理及流程介绍
具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min〔RT 避 光〕。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
80年月 Hsu 等建立了抗生物素—生素 〔ABC〕法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年月 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法快速进展。 2023年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合争论的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应当把握的根本技术之一。
免疫组化原理及流程介绍
留意事项：
• 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳 性染色的位置。
• 2.切片脱蜡和水化要充分；加反响液时要掩 盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但 又防止干片 。
免疫组化原理及流程介绍
• 3.以下缘由可能导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，马上放入新颖
具体操作：
1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈四周的水吸去，参加已 稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反响
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生 物素过氧化酶连接法。
该法是ABC法根底上的进一步改进， 使卵白素与链霉〔而非生物素〕结合， 而后再结合PO基。
免疫组化的原理及流程介绍
• 主要内容
一.免疫组化的进展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的根本流程 四.免疫组化的结果分析
免疫组化原理及流程介绍
一.进展简史
免疫组化原理及流程介绍
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年月 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。 70年月 Stemberger 改进上述技术，建立辣 根过氧化物酶——抗体过氧化物酶〔PAP〕技 术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
1.防止脱片；2.使抗原 抗体结合更稳定。
免疫组化原理及流程介绍
具体做法：
甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织四周 残留血清，直接参加已稀释的一抗〔1： 250、500、1000〕后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
免疫组化原理及流程介绍
6.二抗孵育
免疫组化原理及流程介绍
三 免疫组化的根本流程
1.脱蜡与水化
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原打算簇
4.封闭非特异性 蛋白
5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反响
8.显色
9.复染、脱水、 透亮、封片
1.脱蜡与水化
免疫组化原理及流程介绍
片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸 酒精中数秒〔肯定动作要快〕后拿出流水 振洗，在放入氨水中返蓝即可。
免疫组化原理及流程介绍
• 1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一 大滴苏木素染液，〔胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋 白染 20 s 〕，自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。
附剂太厚。
免疫组化原理及流程介绍
（3）所有切片背景过深
① 内源性过氧化酶没有完全阻断 ② 切片或涂片过厚 ③ 漂洗不够 ④ 底物呈色反清抗体稀释不够
免疫组化原理及流程介绍
〔4〕阳性比照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反响。
最常见的缘由是：
标本的固定和处理不当
• 3) 透亮：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
• 4) 封片：中性树胶。
免疫组化原理及流程介绍
四 免疫组化结果分析
免疫组化结果的推断原则： 1.必需设比照。 2.抗原表达必需在特定部位。 3.阴性结果不能视为抗原不表达。
免疫组化原理及流程介绍
试验分析的相关介绍
照
照
组
结论
6
＋
－
－
－ 受检组织不含定位Ag
7
＋
－
－
＋
受检组织含定位Ag
• 从表上可以看出，只有6，7试验结果有 意义。1～5均因比照组的结果已否认Ab 的特异性或因IHC技术操作存在错误等而 使试验结果失去意义，必需重复试验或 换用 Ab.
免疫组化原理及流程介绍
★除上述比照结果分析之外，还必 需从以下几个方面综合评价：
阳性 阴性 替代 实验 对照 对照 对照 组
1
－－
－－
结论
操作错误
2
＋＋
＋＋
非特异性反应
3
＋＋－－
阴性对照含定位Ag
4
－－
－ ＋ 阴性对照不含定位Ag
5
＋－
＋ ＋ 受检组织非特异性染色
6
＋－
－ － 受检组织不含定位Ag
7
＋－－＋
受检组织含定位Ag
免疫组化原理及流程介绍
阳性对 阴性对 替代对 实验
照
免疫组化原理及流程介绍
SP染色法的特点:
灵敏特异性低，本钱低。
具体操作：
1〕 参加 SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2〕 用 PBS 洗 5 次×5 min。
免疫组化原理及流程介绍
8.显色
在免疫组化中，由于抗原抗体所形 成的复合物本身没有颜色，不能直 接观看，只能借助于其他某些化学 基团的显色作用，是复合物显色， 有利于显微镜下观看。
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
免疫组化原理及流程介绍
〔2〕全部切片呈阳性反响，其缘由：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，
洗涤不彻底。 ③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反
响时间过长。 ④抗体温育的时间过长。 ⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快且粘
常用的修复方法从强到弱一般分 为三种，高压修复、微波修复、胰 酶修复。
酶消化方法 一般用于细 胞内抗原
应用高频电磁波 翻开蛋白质间的 交联键
免疫组化原理及流程介绍
具体操作〔微波修复〕：
1) 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液〔pH6.0〕后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。
阳性比照： 用抗原阳性的切片与待检标
本同时进展免疫细胞化学染色。 比照切片呈阳性结果，标为阳性 比照。
阴性比照：
用确证不含抗原的标本作比照， 应呈阴性结果，称阴性比照。其实这 只是阴性比照中的一种，阴性比照还 应包括空白、替代、吸取和抑制试验。
免疫组化原理及流程介绍
免疫组化染色试验组与比照组结果分析表
免疫组化原理及流程介绍
通常在过氧化物酶〔HRP〕法中，显 色剂为DAB。
DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)
配法:DAB
50mg
0.05M TB 100ml
30%H2O2 30-40ul
ABC 法 SP法 PAP法
免疫组化原理及流程介绍
9、复染、脱水、透亮、封片
复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好 地对目标蛋白进展定位，常常用的试剂为苏 木素。
大一点
免疫组化原理及流程介绍
5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
免疫组化原理及流程介绍
• 一抗孵育条件在免疫组化反响中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。
• 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最正确；孵育时间：这与温度、 抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过 夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条 件还要摸索。
免疫组化原理及流程介绍
• 5.PBS的PH和离子强度的使用。
1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质 具有构造性。〔非特异性染色 细胞与 组织无区分〕 ② 染色强度不同：颜色深浅不一〔非 特异性染色 弥散性均匀〕。
免疫组化原理及流程介绍
2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘枯燥—非特异性染色〔常见〕，加 抗体时勿干片。 3．人工假象与特异性结果显示不在同一 平 面上。
4)80% ethanol 2 minutes；
具
5)70% ethanol 2 minutes；
体 操
6)distilled water:5 min；
作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
免疫组化原理及流程介绍
2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进 展结合反响。一般用Triton X-100、蛋 白酶k等通透液。
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团〕，作用是检测一抗。
免疫组化原理及流程介绍
• 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度 30min-1h，具体时间需要摸索。
• 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和 孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵 育时间。
免疫组化原理及流程介绍
的 二甲苯中； • ② 水化不全。应常常配制新颖的梯度乙醇； • ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； • ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； • ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 • ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
免疫组化原理及流程介绍
• 4.一抗的清洗：
〔1〕单独冲洗，防止穿插反响造成污染。 〔2〕温顺冲洗，防止切片的脱落。推举 用浸洗方式； 〔3〕冲洗的时间要足够，才能彻底洗去 结合的物质。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理及流程介绍
3. 抗原修复 暴露抗原打算簇
由于组织中局部抗原在甲醛或多聚 甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交 联及醛基的封闭作用，从而失去抗原 性；通过抗原修复，使得细胞内抗原 打算簇重新暴露，提高抗原检测率。
免疫组化原理及流程介绍
抗原修复的主要方法:
• 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol 〔1-2〕 min； 95% ethanol 〔1-2〕 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理及流程介绍
4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有穿插反响的位点发生结合。
免疫组化原理及流程介绍
具体操作：
将切片取出,四周水分用滤纸吸干,用组化笔在 组织四周画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清 〔与二抗来源全都〕后放入湿盒中,室温 (约 30℃)下10～30min。
免疫组化原理及流程介绍
▲染色失败的几种缘由：
染
(1)所染的全部切片均为阴性结
色
果，包括阳性比照在内。
失
败
(2)全部切片均呈阳性反响
的
可
(3)全部切片背景过深
能
状
(4)阳性比照染色良好，检测的
况
阳性标本呈阴性反响
免疫组化原理及流程介绍
(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
免疫组化原理及流程介绍
二 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是 指带显色剂标记的特异性抗体在组织 细胞原位通过抗原抗体反响和组织化 学的呈色反响，对相应抗原进展定性、 定位、定量测定的一项新技术。
免疫组化原理及流程介绍
它把免疫反响的特异性、组织化学的可 见性奇妙地结合起来，借助显微镜(包括 荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大 作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原 物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原 体以及受体等)。
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他 试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反响。假设脱蜡和水化不全易消失局灶 性反响和浸洗不全，而产生非特异性背 景着色。
1)60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2)100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
3)95% ethanol 2 minutes；