环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对早期糖尿病大鼠视网膜组织促红细胞生成素的影响

环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对早期糖尿病大鼠视网膜组织促
红细胞生成素的影响
潘桂萍;刘光辉;谢勇军
【摘要】目的：观察塞来昔布环氧合酶-2（ COX-2）选择性抑制剂引起糖尿病大鼠视网膜组织促红细胞生成素的改变，探讨其防治早期糖尿病视网膜的机制。

方法40只SD雄性大鼠随机分为4组，即正常组、糖尿病组、对照组、实验组，每组10只。

1％链尿佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型，饲养3个月后，处死大鼠取视网膜，HE染色观察视网膜形态学变化，SYBR荧光实时定量PCR检测视网膜组织中COX-2、EPO mRNA表达变化。

结果3个月后，HE染色糖尿病组和对照组结构出现了改变；COX-2、EPO mRNA在糖尿病组和对照组，组间两两比较，无统计学差异（ P ＜0．05），其余各组间比较均有显著性差异（ P ＞0．05）。

结论塞来昔布能够有效促进EPO的表达，可以用于早期糖尿病视网膜病变防
治。

%Objective To observe the effect of cyclooxygenase-2 inhibitor on the expression of erythropoietin ( EPO) in diabetic rats retina and the effect of celecoxib on prevention of early diabetic retinopathy .Methods Forty SD male rats were randomly divided into four groups:the normal group , diabetes group , control group and experimental group , 10 in each group.Diabetes model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) (50 mg/kg).All of the rats were sacrificed at 3 months.Retinae were HE stained to observe morphological changes , and SYBR real-time fluo-rescent quantitative PCR was used to detect COX-2 and EPO mRNA expression changes .Results After 3 months, HE staining showed structural changes in diabetes group and control group .There was
no difference in COX-2 or EPO mRNA expression between diabetes group and the control group ( P <0.05), but between diabetes group and other two groups ( P <0.05).Conclusions Celecoxib could effectively promote the expression of EPO , thus can be used for early preven-tion and treatment for diabetic retinopathy .
【期刊名称】《临床眼科杂志》
【年(卷),期】2014(000)002
【总页数】4页(P176-179)
【关键词】环氧合酶-2抑制剂;塞来昔布;糖尿病;糖尿病视网膜病变;促红细胞生成素
【作者】潘桂萍;刘光辉;谢勇军
【作者单位】442000，湖北十堰，湖北医药学院附属太和医院;350004，福建福州，福建中医药大学附属人民医院;442000，湖北十堰，湖北医药学院附属太和医院
【正文语种】中文
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是全球重大的致盲性眼病之一[1]，DR发病机制的研究是当今眼科学重要的研究课题。

越来越多的研究表明炎症反应异常激活引起的视网膜微血管损伤在DR的发病机制中起重要的作用[3，4]。

环氧化酶-2( cyclooxygenase，COX-2) 属于诱导型酶，与炎症、肿瘤等病理状态下新生血管的生成密切相关，并参与了DR的病理过程[4，5]。

而促红细胞生成素
(erythropoietin, EPO) 是一种糖蛋白类激素[6]，能够减轻DR病理过程中的炎症
反应，对DR微血管病理损害具有保护作用[7]。

本文拟探讨COX-2选择性抑制剂塞来昔布对糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠视网膜EPO表达的影响及其防治早期DR的具体作用机制。

资料与方法
一、动物模型建立及处理
研究对象为SPF级健康Sprague-Dawley(SD)大鼠、雄性、体重为230～260 g，平均(244±23)g，共40只。

实验随机分为正常组、DM组、对照组和实验组，每组10只大鼠。

正常组不予任何处理，常规喂养。

DM组、对照组和实验组大鼠禁食12 h，以1%链尿佐菌素50 mg/kg腹腔注射诱发DM，72 h后用美国强生公司血糖仪检测尾部末梢血糖值，血糖大于16.7 mmol/L，尿量、饮水明显增多即
为模型建立成功；在DM造模成功后，DM组予以常规喂养。

实验组按体重40
ml/kg，1 mg/ml塞来昔布溶液灌胃，1次/d，每次平均5 s，灌胃时间为3个月。

对照组按照相同的方法给予等体积的蒸馏水。

建模成功后每周监测记录血糖、体重。

3个月后DM大鼠的平均体重及血糖值与正常组大鼠比较差异有统计学意义
(P<0.05)
图1 视网膜HE染色片400倍 A 正常组；B DM组；C 对照组；D实验组
二、光学显微镜观察
大鼠喂养3个月后，给予水合氯醛1.2 ml/kg腹腔注射麻醉处死大鼠，立即摘除
双眼眼球，通过4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、石蜡包埋处理后，行与视神经矢状轴平行的3 μm 厚度连续切片。

伊红染色后，使用光学显微镜观察并且照相记录。

三、SYBR green实时定量PCR检测视网膜COX-2、EPOmRNA水平
处死大鼠后，立即取出大鼠双眼眼球，环形剪开角膜，去除晶状体、玻璃体，取出视网膜组织，常规提取视网膜RNA，紫外吸收法测定视网膜RNA纯度，逆转录
合成视网膜cDNA，以cDNA 为模板1 μl，上下游引物1 μl，SYBR Green mix 12.5 μl，总体系为25 μl；反应参数为50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，72 ℃ 10 min，荧光检测1次，共40个循环。

每组设3个复孔，即n=3。

表1 各检测基因的引物序列及退火温度Gene引物序列目的片段长度(bp)退火温
度β-actinF-5’CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’110bp60 ℃R-
5’TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’COX-2F-
5’ATTCTTTGCCCAGCACTTCACT-3’210 bp58 ℃R-
5’GTGTCTTTGACTGTGGGAGGATAC-3’EPOF-
5’CACCCTGCTGCTTTTACTATCCTT-3’139bp58 ℃R-5’ CATTGTGACATTTTCTGCCTCCT -3’
四、统计学分析
计量资料数据(糖尿病大鼠体重)以均数±标准差表示，用SPSS 13统计分析软件，对糖尿病大鼠体重及血糖值进行正态分布检验和方差齐性检验，采取组间t检验，P﹤0.05为差异具有统计学意义。

结果
一、造模情况
糖尿病大鼠每周监测血糖均大于16.7 mmol/L，正常组大鼠于正常范围之内，正
常组大鼠与糖尿病组大鼠、对照组和实验组两组相比较有统计学差异(P<0.05)，
糖尿病大鼠与对照组和实验组两组间血糖相比较无统计学差异(P>0.05);正常组大
鼠的体重足周增加，糖尿病组、对照组和实验组的大鼠体重明显减轻，正常与其他三种相比较有统计学差异(P<0.05)，其他三组间比较无明显统计学差异(P>0.05)。

二、镜下视网膜形态学变化
正常组大鼠视网膜结构清晰，排列整齐，染色均匀；(图1 A)。

DM组和对照组视
网膜各层结构排列紊乱，毛细血管扩张，周细胞核固缩、颗粒细胞层染色不均匀(图1 B, C)。

治疗组结构尚清晰，细胞核水肿(图1D)。

三、SYBR荧光实时定量PCR检测结果
PCR检测结果显示，β-actin、COX-2和EPO的溶解温度分别为86.8 ℃、89.0 ℃和94.1 ℃，均存在单一的溶解峰，表明各因子为特异性扩增。

COX-2和EPO mRNA在 DM组、对照组、治疗组大鼠视网膜中表达相对量分别是9.57±0.33、7.89±0.24、3.27±0.26和3.06±0.30、3.23±0.37、5.45±0.41(见图1A)
表2 COX-2和EPO的mRNA表达情况COX-2 mRNA EPO mRNA正
常组 1 1DM组9.57±0.33 3.06±0.30对照组7.89±0.24 3.23±0.37实验组
3.27±0.26 5.45±0.41
讨论
DR为DM最常见的微血管并发症之一，缺乏有效的防治方法。

其即使在代谢控制
稳定的情况下，仍可能继续发展[9]，常因视网膜新生血管的生成而最终致盲。

因此，开展早期DR的防治研究是防盲治盲的一个重要课题。

自上世纪90年代以来，免疫炎症因子在DR发病过程的作用得到认识并日益受到
重视[10，11]，其被认为在DR的发生、发展中起到中心作用[3]。

COX-2是一种
重要的炎性因子，是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢的一种重要酶。

其在
炎性介质及相关细胞因子的刺激下可以迅速出现诱导性表达，催化AA生成前列腺素，前列腺素可以增加血管通透性，引发微血管病理改变。

DR是DM在视网膜微
血管并发症，近年来研究表明COX-2与糖尿病视网膜病变发生具有重大相关性[4，5]。

COX-2在正常的视网膜组织中不表达。

在糖尿病视网膜病变患者中，COX-2
于视网膜神经纤维层、神经节细胞层、色素上皮层、光感细胞层均出现表达[12]。

动物实验证明COX-2在早期糖尿病大鼠(DM造模成功后1周)视网膜细胞中即呈高表达，并随时间的延长而表达量及范围逐渐增加[5]。

Oh等认为没有炎症就没有新生血管的生产，且视网膜新生血管生产的速度与炎症反应的程度在某种程度上成正比[13]。

研究发现在DR大鼠中COX-2在视网膜新生血管生成中过度表达，如果对COX-2进行调控，则可以控制DR的发展，阻止视网膜血管渗漏，防止糖尿病视网膜血管的增生性改变[14]。

本研究结果显示DM大鼠视网膜组织中COX-2 mRNA的表达增加，与既往报道[5]一致。

塞来昔布是COX-2的选择性抑制剂，其能抑制环氧合酶阻断花生四稀酸合成内源性PG，减轻组织的炎症；可以用于抑制DR血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达，减轻早期DR视网膜超微结构的损害[15]，抑制视网膜新生血管的生成[16]。

本研究结果表明应用塞来昔布可以降低DM大鼠视网膜COX-2 mRNA的表达，减轻糖尿病视网膜组织结构的损害，提示塞来昔布可以用于早期DR的防治。

EPO是一种刺激造血系统的糖蛋白类激素[6]，除能够促进红系祖细胞增生、分化及成熟外，还可以对人和动物神经系统产生保护作用。

其广泛存在于神经系统，在视网膜及视网膜神经细胞层都有表达，在视网膜色素上皮层呈现高表达。

近年研究表明EPO是中枢神经包括视网膜损伤反应的重要介质，在DR的发生发展中也发挥了重要的作用[17，18]。

在DR中，EPO表达升高并随病程的延长而增加[19]。

EPO表达升高在DR不同的病理阶段具有不同的效应，或抑制视网膜损害(早期)，或刺激视网膜新生血管生成(增生期)[20]。

在DR早期，EPO表达升高对视网膜具有保护作用。

其可以抑制视网膜视神经元的凋亡[21]，甚至逆转大鼠糖尿病神经病变[22]；降低血管通透性来拮抗血管内皮生长因子诱导的微血管损害[23]，保护血视网膜屏障[24]。

这些保护效用在DM模型动物玻璃体腔内注射外源性性EPO的研究中得到了证实[17]。

这就意味着调控EPO用于防治早期DR的可能。

本研究发现，糖尿病大鼠视网膜中EPO mRNA表达与正常组相比较在3个月时即明显增
高，这与李厚硕等[19]采用免疫组化方法检测的结果一致。

我们通过选择性COX-2的抑制剂塞来昔布来观察视网膜EPO的变化，发现塞来昔布治疗组EPO的表达量增高，视网膜组织结构改变程度轻，表明塞来昔布可能可以通过EPO的途径来作用于实验性DM大鼠的视网膜，抑制DM视网膜损害的发生。

EPO在兴奋性、毒性、缺血、炎症损伤等创伤中保护效应的主要机制是抑制临近的组织坏死凋亡及直接抑制促炎症细胞因子的表达。

但是炎症反应也可以通过多种途径抑制EPO的活性，释放细胞因子直接抑制内源性EPO的合成。

塞来昔布除了能够抑制COX-2的活性外还可以抑制“NF-κB”“iNOS”“ TNF-α”等诸多炎性因子，通过这些途径来刺激EPO的表达，除此之外，研究表明，塞来昔布可以抑制新生血管促进因子VEGF的表达，VEGF与EPO在新生血管生成中存在着时间的一致性。

结论：COX-2抑制剂塞来昔布能够降低实验性DM大鼠视网膜COX-2的表达，提高EPO的表达，减轻DM导致的视网膜组织损害，可以用于早期DR的防治，但是具体机制有待进一步研究。

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