Ras 相关区域家族1A 基因在喉癌及喉角化症组织中的表达及临床意义

Ras 相关区域家族1A 基因在喉癌及喉角化症组织中的表达及
临床意义
李万举;孙敬武;别远志
【摘要】目的：探讨Ras相关区域家族1A基因（Ras association domain family 1A，RASSF1A）的表达与喉癌发生发展的关系。

方法收集喉角化症组织43例、喉鳞癌组织31例作为实验组，取冷冻新鲜尸头正常声带黏膜8例作为正常对照组，用免疫组织化学方法检测各组组织的 RASSF1A 蛋白表达情况并进行分析比较。

结果正常喉黏膜、喉角化症及喉鳞状细胞癌组织中 RASSF1A 阳性细胞表达率分别为58．25％±8．8％、47．22％±2．25％和21．36％±10．98％，喉鳞状细胞癌组织中 RASSF1A 的表达强度低于喉角化症及正常喉粘膜组织，差异均有统计学意义（P＜0．05），喉角化症与正常喉黏膜组织中的 RASSF1A 阳性表达率差异无统计学意义（P＞0．05）。

在 I～IV期喉癌组织中 RASSF1A 的表达强度逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0．05），而高分化、中分化及低分化癌组织中 RASSF1A 阳性细胞表达率比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。

结论RASSFlA 表达降低可能与喉鳞状细胞癌的发生发展有关，对鉴别癌前病变与喉癌具有一定意义。

%Objective To observe the RASSF1A expression in laryngeal keratosis and laryngeal squamous cell carcinoma and investigate the relationship between the gene and the occurrence and development of this disease. Methods The specimens of keratosis of larynx(43 cases)and laryngeal squamous cell carcinoma(31 cases)in Oto-laryngology-Head and Neck surgery of Anhui provincial hospital from Dec 2009 to Dec 2012 were collected.Nor-mal vocal fold mucosa from the cadaveric head as control group(8 cases)were collected.Immunohistochemical meth-ods were used
to detect the expression of RASSF1A protein in these tissues.The diffuse distribution of brown gran-ules in the cell cytoplasm yielded positive results and the nucleus was not coloring.The percentage of positive cells of every section,and the average standard deviation(￣x±s)were calculated.SPSS17.0 statistical analysis software was used to analyze the data,P<0.05 for the difference was statistically significant.ResuIts The RASSF1A expes-sion in laryngeal squamous cell carcinoma,normal laryngeal mucosa,squamous cell carcinoma of the larynx and la-ryngeal keratosis were compared.The differences of RASSF1A expression were statistically significant (P<0.05). The difference of RASSF1A expression in keratosis of larynx and normal laryngeal mucosa was not significant (P>0.05).RASSF1A expression in the clinical stage from I to IV of laryngeal squamous cell carcinoma gradually de-clined.During the clinical stage,the difference had statistics significance (P<0.05 ).In high differentiated squa-mous cell carcinoma,moderately differentiated squamous and poorly differentiated squamous,the differences of RASSF1A&nbsp;expression were insignificant (P>0.05).ConcIusion The reduction of RASSF1A expression correlated with laryn-geal squamous cell carcinoma,which has certain significance for the different ion of carcinoma and laryngeal precan-cerous lesion.
【期刊名称】《听力学及言语疾病杂志》
【年(卷),期】2014(000)006
【总页数】4页(P616-619)
【关键词】喉癌;喉角化症;Ras 相关区域家族 1A 基因
【作者】李万举;孙敬武;别远志
【作者单位】安徽省立医院耳鼻咽喉头颈外科合肥 230001;安徽省立医院耳鼻咽
喉头颈外科合肥 230001;安徽省立医院耳鼻咽喉头颈外科合肥 230001
【正文语种】中文
【中图分类】R739.6
喉癌是发生于喉黏膜上皮的恶性肿瘤，组织学上以鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)最常见，约占全部喉癌病例的95%～98%。

喉鳞状细胞癌的发生过程中有许多致病因素在共同发挥作用，除了癌基因被激活外，一些因素引起的抑癌基因失活是另一个十分重要的因素[1]。

Ras相关区域家族1A基因(Ras association domain family 1A, RASSF1A)是由Damman等[2]在2000年对肺
癌组织的研究中发现的一种基因。

目前认为，RASSF1A基因抑制肿瘤的机制是该基因干预细胞周期的进程，并可以抑制细胞生长、促进细胞凋亡。

某些因素导致RASSF1A基因的启动子发生甲基化之后会进一步引起RASSF1A基因失活并最终
导致组织细胞周期紊乱而发生癌变[3，4]。

喉角化症是喉部黏膜上皮生长、成熟异常以及黏膜上皮过度角化的一种增生性病变，目前喉角化症与成人喉乳头状瘤及慢性肥厚性喉炎均被认为是喉的癌前病变[5]。

本研究拟通过对正常喉粘膜、喉角化症及喉鳞状细胞癌组织中RASSF1A的表达对比研究，初步探讨RASSF1A基因在喉角化症及喉鳞状细胞癌的发生发展过程中的意义。

1 材料与方法
1.1 喉组织标本的采集及分组收集自2009年12月到2012年12月安徽省立医
院耳鼻咽喉头颈外科确诊并行手术中切除的喉鳞状细胞癌、喉角化症组织标本共
74例为实验组，其中男68例，女6例，年龄23～77岁，平均47岁；分为2组：
①喉鳞状细胞癌组织31例，其中男30例，女1例；高、中、低分化鳞癌分别为
12、14及5例；I、II、III、IV期病例分别为9、5、11、6例；②喉角化症组织
43例，其中男38例，女5例。

对照组为从冷冻新鲜尸头标本取的正常声带黏膜
8例。

1.2 免疫组化染色方法各组标本取材后以4%甲醛固定脱水后石蜡包埋制作切片，片厚4 μm。

石蜡切片常规脱蜡，PBS洗3次各3分钟；滴加3%H2O2，37 ℃静置10分钟，PBS洗3次各3分钟；微波修复，高火5分钟，冷却后，重复一次；PBS洗3次各3分钟，滴加正常山羊血清封闭液，室温30分钟；滴加I抗(1：200稀释)50 μl/片，4 ℃过夜；过夜后室温复温20分钟，PBS洗3次每次5分钟，滴加II抗工作液50 μl/片，37 ℃ 30分钟；PBS洗3次各5分钟，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液50 μl/片，PBS洗3次各5分钟；DAB显色5～10分钟，在显微镜下观察染色程度；自来水冲洗后苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化数秒，
自来水冲洗10～15分钟；脱水、透明、封片、烤片后进行显微镜拍照。

1.3 结果判定标准RASSF1A蛋白免疫组化染色阳性显色与细胞浆出现棕黄色颗粒，呈弥漫性分布，胞核不着色。

每例切片随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野
中计算100个组织细胞中RASSF1A阳性细胞的数量。

每个视野下的阳性细胞百
分数(%)=阳性细胞数量/总细胞数×100%，取其平均值±标准差
1.4 统计学方法采用SPSS17.0统计分析软件对正常喉黏膜组、喉角化症组及喉鳞状细胞癌组的阳性细胞百分数进行单因素方差分析(one-way ANNOVA)，两组间比较用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
RASSF1A在正常喉粘膜组织和喉角化症组织中呈强阳性表达(图1、2)，在喉鳞状细胞癌中呈弱阳性表达(图3～5)，其在正常喉粘膜、喉角化症及喉鳞状细胞癌组中的阳性细胞表达率分别为58.25%±8.89%、47.22%±2.35%及
21.36%±10.98%；RASSF1A在喉鳞状细胞癌的表达低于喉角化症组织和正常喉组织，差异均具有统计学意义(P<0.05)；喉角化症组织中RASSF1A表达阳性率与正常喉粘膜组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 RASSF1A在正常喉黏膜中的表达呈强阳性(+++) (免疫组化×400)图2 RASSF1A 在喉角化症中的表达呈强阳性(+++) (免疫组化×400)图3 RASSF1A在喉癌中的表达(高分化鳞癌) 呈弱阳性(+) (免疫组化×400)图4 RASSF1A在喉癌中的表达(中分化鳞癌) 呈弱阳性(+) (免疫组化×400)图5 RASSF1A在喉癌中的表达(低分化鳞癌) 呈弱阳性(+) (免疫组化×400)
RASSF1A在I～IV期喉鳞状细胞癌组织中的表达呈逐渐下降趋势，各组间差异具有统计学意义(P<0.05) (表1)。

而高分化、中分化及低分化鳞状细胞癌组织中RASSF1A阳性细胞表达率的比较，差异无统计学意义(表2)(P>0.05)。

表1 I～IV期喉癌组织中的RASSF1A阳性表达率比较(%)临床分期例数(例)阳性细胞率FPI936.89±3.16II526.46±2.800.840.024III1116.93±2.57IV68.20±1.62
表2 不同分化程度喉癌组织中的RASSF1A阳情表达率(%)分化程度例数阳性细胞率FP高分化1221.76±12.01中分化1426.43±9.461.670.32低分化
520.72±11.07
3 讨论
Ras相关区域家族1A(Ras association domain family1A,RASSF1A) 基因[6]定位于人类3p21.3染色体,由Damman等[2]在肺癌组织中分离得到。

随后在多种肿瘤如鼻咽癌、淋巴瘤等恶性肿瘤组织中都发现了RASSF1A基因的异常表达，并有国内外学者对其进行了进一步深入的研究[6，7]。

在Ras信号传导通路中，
RASSF1A蛋白是一种参与细胞周期调控的重要抑制蛋白，它通过多种途径抑制细胞生长，促进细胞凋亡和衰老。

其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯结合区高度同源，也被称作蛋白激酶C保守区1(C1)。

如果将RASSF1A转染入不表达该基因的癌细胞株，可以发现肿瘤细胞克隆的形成和非贴壁肿瘤细胞的生长受到明显抑制，接种于裸鼠后其成瘤生长能力也明显下降，由此确定了RASSF1A作为抑癌基因的作用[8]。

Jaroslaw等[9]对41例喉鳞状细胞癌组织进行相关研究后认为，RASSF1A可以阻断Ras-RASSF1-ERK通路的信号传导,使Ras生长效应信号不能够从细胞外转向细胞内,从而丧失促进细胞增殖、介导细胞分化和激活原癌基因的功能,通过这种机制来发挥抑制细胞癌变的作用。

许承弼等[10]报道喉鳞状细胞癌组织中RASSF1A蛋白的表达强度明显低于癌旁组织和正常喉组织，提示喉鳞状细胞癌的发生与RASSFlA蛋白表达降低有关，并且认为RASSFlA的表达与喉鳞状细胞癌的临床分期有关，不同临床分期喉鳞状细胞癌组织RASSFlA蛋白的表达程度不同，临床分期越晚，RASSFlA蛋白表达水平越低，提示RASSFlA的表达与肿瘤的侵袭、转移有关。

从本研究结果看，喉鳞状细胞癌组织中RASSF1A蛋白的表达低于正常喉组织，且I～IV期喉癌组织中其表达强度也逐渐降低，与上述文献相符，表明RASSFlA蛋白表达降低与喉鳞状细胞癌的发生及发展过程有关。

在本组所有喉鳞状细胞癌组织中，高分化、中分化及低分化癌组织中RASSF1A表达水平无明显差异，表明喉鳞癌的细胞分化水平与RASSF1A基因表达水平无关，说明RASSF1A 基因作为一种抑癌基因，发生缺失或突变后可导致细胞癌变，但并不能决定癌细胞的分化程度。

郭伟等[11]在对喉癌及癌前病变中细胞周期调控基因甲基化的研究中发现，细胞周期调控基因p14、p15及p16基因启动子及甲基化在正常喉组织、喉角化症及喉鳞状细胞癌组织中基因启动子过甲基化及蛋白表达水平呈逐渐变化的趋势，说明在
喉黏膜组织由正常向癌前病变进而转变为恶性肿瘤过程中，与相关基因的异常表达有关。

本研究发现，在喉角化症组织中，RASSF1A蛋白表达低于正常喉黏膜组织，差异无统计学意义，不能认为抑癌基因RASSF1A基因的表达降低与喉角化症的发生有关；但是，RASSF1A基因在喉鳞状细胞癌组织中的阳性表达率高于喉角化症组织，至少提示RASSF1A基因可能参与了喉鳞状细胞癌发生的早期过程，可将其作为喉鳞状细胞癌的早期预警指标，在鉴别某一喉部病变是否已由癌前病变恶变为喉癌时可能有一定意义。

综上所述， RASSFlA蛋白在喉癌组织中的表达强度明显低于正常喉组织，且临床分期越晚，表达强度越低，提示该蛋白表达降低与喉鳞状细胞癌的发生发展可能有关；对RASSFlA蛋白表达水平进行检测，有助于筛查RASSFlA基因异常的人群，提高喉鳞状细胞癌的早期诊断水平，并对鉴别癌前病变与喉癌有一定意义。

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