气道炎症中p38MAPK及核因子κB对一氧化氮合酶的调控

气道炎症中p38MAPK及核因子κB对一氧化氮合酶的调控
田伟千，傅诚章，朱敏敏
（南京医科大学第一附属医院麻醉科，江苏南京210029）[摘要] 气道炎症性疾病是由多种细胞因子、炎性介质介导的变态反应性疾病，一氧化氮（NO）作为生物体内一个重要的信使分子和效应分子,参与许多生理和病理过程，大量的NO可引起气道炎症和肺损伤等不良反应。

p38蛋白激酶(p38 MAPK)可能与气道炎症性疾病的发病机制密切相关，且能调控诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 的表达及NO 的产生。

同时，p38MAPK 还是NF-κB的重要上游调控因子。

作为一种多极性基因调控蛋白, 核因子κB(NF-κB)能从基因转录水平调控iNOS的合成,因而对NO具有重要的调节作用。

NO对p38MAPK和NF-κB也有一定的反馈调节作用。

[关键词] 气道炎症；p38MAPK；NF-κB；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮
P38 Mitogen activated Protein Kinase and Nuclear Factor-κB Modulate the inducible Nitric oxide Synthase in airway inflammation
Tian Weiqian , Fu Chengzhang, Zhu Minmin . Department of Anesthesiology ,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University , Nanjing 210029 CHINA
[Abstract]Airway inflammatory disease is characterized by allergic airway inflammation,which is mediated by various cytokines and inflammatory mediators. As an important signaling and potent molecule, NO is involved in numerous
pathophysiological processes in creature bodies. Excessive production of endogenous NO in airway inflammatory disease may contribute to many adverse responses ,such as airway inflammation and lung injury etc. P38 Mitogen activated Protein Kinase ,which is likely to correlate closely with the pathogenesis of airway inflammatory disease,could Modulate iNOS mRNA expression and NO production, and p38MAPK is also an important upstream regulating factor. As a multipolar gene modulin,NF-κB can modulate the biosynthesis of inducible nitric oxide synthase at the level of nuclear transcription,thereby it is a critical factor in regulating NO production.However, No also shows a feedback regulation effect on p38MAPK and NF-κB.
[Key words] airway inflammation; P38 mitogen activated protein kinase; nuclear factor-κB; inducible nitric oxide synthase; nitric oxide
一氧化氮(NO) 是一种活跃的信号小分子,参与机体多种生理和病理过程。

当它作为一种炎性介质时,主要由诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 催化底物左旋精氨酸而生成。

气道炎症中, NO 的大量生成与iNOS 的异常表达有关，目前已明确iNOS的调控主要取决于基因表达的调控。

但iNOS 表达的具体调控机制尚未完全明确。

近年来研究表明核因子κB(NF-κB) 是炎症性疾病的关键转录因子,调控着多种炎症基因的表达。

它在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。

作为MAPKs 家族成员之一, P38MAPK参与了炎症、应激反应的调控密切相关，被认为是细胞信息
传递的交汇点，能调节转录因子的活性及细胞因子的合成，对炎症反应的调控有着关键性的作用[1]。

本文就气道炎症中p38MAPK及NF－κB对iNOS及NO的调控机制作一综述。

1 NO及其合酶的生物学特征
NO 是一个具有自由基性质的生物信息分子和效应分子,它可参与体内多种生理和病理反应过程。

NO是由NOS作用下合成的。

根据功能的不同，一氧化氮合酶分为两型，即原生型一氧化氮合酶（cNOS）和iNOS，其中cNOS 包括内皮型NOS(eNOS) 和神经元型NOS(nNOS) , cNOS主要调节生理功能，iNOS在病理状态下产生，在疾病的发生和病理过程中起着重要而复杂的作用[2]。

在正常生理状态下，cNOS诱导产生低浓度的NO对气道平滑肌具有直接的舒张作用，气道非肾上腺能、非胆碱能神经系统以NO为介质亦可增强支气管扩张。

作为血管舒张因子,NO参与细胞内信号转导,具有舒张动脉、降低血小板黏滞性、减少血小板聚集、抑制粒细胞的移位和聚集,减少黏附分子的表达[3]，故适量的NO 对机体有保护作用。

在哮喘状态下，过敏原及IFN-γ、IL-1、TNF-α等细胞因子诱导肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞中iNOS 表达增加，由iNOS诱导产生大量的NO[4]。

过量的NO不仅可直接造成细胞损伤，还可与同时产生的超氧阴离子生成许多衍生物。

这些物质多为氧自由基，能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，如醛基(MDA) 、酮基以及新的氧自由基，引起细胞损伤[5]。

此外，NO 极易与氧自由基反应产生过氧亚硝基阴离子，它具有比NO 和氧自由基
更强的细胞毒性作用。

近年来的研究证实，NO 这一高效而多样性的生物调节分子可直接参与细胞因子特别是与炎症有关的细胞因子的调节。

此外,还可能通过NO 的细胞内信号传导作用直接作用于核因子NF-κB 等，影响不同细胞因子的合成[6]。

Takano等[7]认为，NO可能直接参与了哮喘炎症过程的调控。

2 NF-κB的生物学特征
2. 1 NF-κB 的结构与活性调节
NF -κB是一类能与多种基因启动子部位的κB位点特异性结合并促进转录的蛋白质的总称。

具有多向转录调节作用，参与多种与免疫和炎症反应有关的基因转录调控，在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类等参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。

几乎存在于所有的细胞中,对细胞的生长、分化、黏附、凋亡及炎症反应等具有重要的调节作用。

典型的NF-κB由两个亚单位P50、P65/ c-Rel 组成。

当细胞未受到适当刺激时,细胞中的NF-κ B 处于未活化状态,不具有调节转录的能力,此时NF-κ B 与一类被称作I-κ B 的抑制蛋白结合在一起,位于细胞质中,并且其P65 被封闭,不能被抗P65 抗体识别。

当细胞受到LPS 等胞外信号刺激时, I-κ B 发生磷酸化降解,NF-κB 与I-κ B 发生解离,NF-κ B 迅速从细胞质移位到细胞核,在核内与目的基因上的κ B 位点特异性结合,从而促进相关基因的转录,NF -κB 可以调节多种炎症基因如TNF-α、IL- 6、IL- 8 和iNOS 的表达, 而这些炎症基因的活化可能参与了肺部炎症。

I-κ B 基因的启动子中
含有3 个κ B 结合位点,NF-κ B 活化后可上调I-κ B 的基因表达,新合成的I-κ B 进入细胞核与NF-κ B 结合,使NF-κ B 从其结合的DNA κB 位点上脱离并重新转位入细胞浆,NF-κB 的激活被终止,此为负反馈调节形式。

但NF-κ B 许多调控基因的表达产物(如TNF-α、IL-1β等) 同时又是NF-κB 的激活物,参与了NF-κ B 的正反馈调节形式。

2. 2 NF-κB对i NOS的调控作用
受NF-κ B 调控的基因表达产物囊括了大多数参与气道炎症形成的主要细胞因子和炎症介质,提示NF-κB在气道炎症的发病中起重要作用。

前炎症细胞因子如TNF-α,IL-1β或氧化物均可明显激活人外周血单核细胞、气道上皮细胞及肺组织细胞内NF-κB。

在气道炎症的形成过程中,NF-κ B 的激活起一定作用。

NF-κ B 进入核内后,与其靶基因中启动子或增强子的κ B 基序结合,从而诱导许多因子的转录。

研究[8]显示大鼠iNOS 基因启动子区域含有两个κ B 调节区, 分别位于-48bp～-209bp 和-913bp～-1029bp , 是NF-κB 依赖性基因。

Matsumura 等[9]亦证实iNOS 基因表达依赖于NF-κ B 的活化。

有学者[10]在大鼠肺泡巨噬细胞中证实了NF-κ B 可通过与编码iNOS 基因上的κ B 位点结合,从而促进iNOS 转录,iNOS 生成增加。

核因子-κ B 活化后iNOS 表达增高,引起大量的NO 产生, iNOS 的表达受到NF-κ B 活化的调节，抑制NF -κ B 活化，则iNOS 的表达下降。

NF -κ B 活化在气道炎症发生机制中起作用,并通过抑制iNOS 的表达来抑制NO 的过量产生。

这样, 从NF-
κB 信号转导水平进行干预, 可能为适度调节体内NO 的诱生开辟新的途径。

由于iNOS、TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子基因启动子上均存在NF-κ B 的结合位点, 抑制NF-κ B 通路活化一方面阻止iNOS 转录及NO 的过度产生, 另一方面可减少TNF-α、IL-1、IL-6 等炎性介质的合成与释放, 从而减轻肺组织炎症反应, 对器官功能起到保护的作用。

NO对NF-κB的反馈调节作用
通过外源性NO干预内毒素(LPS)诱导肺泡巨噬细胞（PAM）,观察到NF-κB活性降低,说明NO 在炎症因子产生中起负反馈作用,而NO 在此过程中能降低前炎症介质TNF-α的机制可能是通过抑制巨噬细胞内的NF-κB活性, 从而减少TNF-α的基因转录,精氨酸是内源性NO 的前体,精氨酸缺乏将导致NO 不足, 引发炎症失控[11]。

有研究[12]认为外源性NO 通过抑制内源性NO释放,不仅能从基因表达水平上抑制炎症反应, 同时对炎症反应也有抑制作用。

NO对NF -κB的负反馈作用可能是NO 对机体保护作用的主要机制。

Connelly等[13]研究认为NO对鼠巨噬细胞中NF-κB活性具有双向
调节作用，并和NO的局部浓度密切相关。

研究中发现30nM～3mM的NO 对NF-κB的活性有促进作用，30mM～300mM的NO对NF-κB有抑制作用。

通过对NF-κB的双向调节作用，不同浓度的NO可以上调或下调iNOS、环氧化酶-2以及IL-6的基因表达。

这一机制至少部分解释了过去的报导中关于NO不仅具有促炎作用，还有抗炎作用的说法。

研究[14]还发现，NO 对Th1 型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子
IL-4、IL-5 的表达具有调控作用。

该调控作用部分地依赖于NF-κ B , 即NO-NF-κ B 信号通路在Th细胞因子的表达中也具有一定的调控作用。

3 p38MAPK的生物学特征
3.1 p38MAPK的结构与活性调节
p38 MAPK是新近发现的与炎症、应激反应密切相关的蛋白激酶,参与了肥大细胞、嗜酸性粒细胞的定位迁移和淋巴细胞的发育、分化、成熟和活化的全过程,提示p38 MAPK可能与支气管哮喘的气道炎症机制相关。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase , MAPK) 是细胞内的一类丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶。

由于其性质的保守性和分布的广泛性, MAPKs 信号途径在信号转导过程中具有重要作用, 是真核细胞转导细胞外刺激到细胞内引起细胞反应的四大信号系统之一[15]。

作为MAPKs 家族成员之一, p38MAPK是1993 年发现的一类新的MAPK 通路。

p38MAPK能促进白细胞的聚集和活化[16]，调节转录因子的活性及细胞因子的合成[17]，对炎症反应的调控有着关键性的作用。

p38MAPK是由360 个氨基酸组成、分子量为38 000ｕB酪氨酸磷酸化蛋白激酶, 属应激激活的蛋白激酶, 能被促炎因子、应激刺激、L PS和G+ 细菌胞壁成分所激活。

研究[18]证实该激酶在LPS 诱导细胞因子的信号转导途径中有重要作用，当细胞外刺激作用于细胞, 即可引起胞质p38MAPK磷酸化, 磷酸化的p38MAPK随即转位到胞核, 激活转录因子Elk-1 、ATF2 和AP-1 等, 启动相关细胞因子和炎性介质的基因
表达。

炎症刺激，如LPS、TNF、IL-1等，均可介导单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞等先天性免疫细胞中p38MAPK的激活
3.2P38MAPK对iNOS的调控作用
p38 蛋白激酶(p38 MAPK)可能与气道炎症性疾病的发病机制密切相关，且能调控诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 的表达及NO 的产生[19]。

Lu 等[20]在肺泡巨噬细胞(PAM)中证明了p38MAPK对PAM分泌NO的作用。

LPS 刺激PAM 引起胞核提取物p38MAPK表达增强, iNOS mRNA 表达以及细胞培养上清NO 代谢产物均显著增加; 应用特异性p38MAPK 抑制剂SB203580 发现, 抑制p38MAPK的活性能显著降低iNOS mRNA 的表达及NO 的产生, 提示LPS刺激p38MAPK活化参与了PAM 的激活以及炎性介质释放的信号转导过程。

Kan 等[21]报道在LPS 刺激后,ECV304 细胞株中iNOS的mRNA 和蛋白水平比基础量均有显著提高,p38MAPK的活性也明显增加,在15min 时到达峰值并维持了约45 min 的平台期,利用SB203580 可显著抑制iNOS 的mRNA 和蛋白水平的表达。

3.3 NO对p38MAPK的反馈调节作用
p38MAPK是丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶,依赖于酪氨酸和苏氨酸残基的磷酸化而激活, NO可引起蛋白酪氨酸残基的磷酸化而激活p38MAPK激酶,活化的p38MAPK又可激活下游的激酶、酶或蛋白,产生生物学作用,因此NO可以通过相继激活p38MAPK、caspase - 3 蛋白酶这个信号转导链而诱导细胞凋亡[22]。

Browning等[23]研究发现LPS刺激中
性粒细胞中p38MAPK的活化，主要通过NO-cGMP途径实现的，LPS刺激引起的NO的大量合成导致了cGMP的积聚，进而引起了蛋白酪氨酸残基的磷酸化而激活了p38MAPK。

研究[24]还证实p38MAPK的抑制剂SB203580可以阻断bax从胞质向线粒体的转移，而NO的供体SNP处理后，激活p38MAPK信号通路的上游激活物MKK3，进而活化了p38MAPK，导致bax转位和细胞死亡。

这些说明，在NO通过刺激bax流入线粒体而导致神经元细胞死亡的过程中，p38MAPK的活化起了关键作用。

然而，也有学者[25]报导，在支气管哮喘患者中，内源性NO过度增多，p38MAPK活性反而下降，从而使嗜酸粒细胞的bcl-2表达减少，细胞凋亡增多。

4 p38MAPK和NF-κB 之间的调控关系
NF-κ B 信号转导通路是炎症反应的关键环节,同时也是体内多条信号途径的共同交汇点。

p38MAPK 是NF-κB的重要上游激酶,可通过直接激活p38MAPK后继而进一步诱导NF-κ B 活化, 促进NO的合成与释放。

Bhat等[26]在探讨p38MAPK激活转录iNOS 基因的作用过程中,在证明这种激活转录作用的同时,还发现这种作用中包含了转录因子NF-κB的参与。

LPS 能使PAM胞核NF-κ B 染色阳性细胞百分比增加, 并且与NO代谢产物、iNOS mRNA 及胞核p38MAPK表达均呈显著正相关。

Nick等[27]证实LPS刺激中性粒细胞能引起p38MAPK上游激酶MKK3的活化，从而使，p38MAPK磷酸化，最终调节细胞间粘附和NF-κB的活化，并增强，TNF-αmRNA的蛋白质表达。

同时，应用特异性p38MAPK抑制剂SB203580 能显著降低NF-κ B 的活化及iNOS mRNA、NO 的表达, 提示p38MAPK可能对NF-κ B 具有正相调控作用。

Alpert等[28]也发现p38MAPK可以抑制TNF-α诱导的NF-κB的活化，由于过去的研究[29]认为p38MAPK能够增强TNF-α的表达，所以有理由认为，p38MAPK可能通过抑制NF-κB的活化，进而抑制了iNOS的诱导。

Guan及其同事[30]证实了p38MAPK可以抑制IL-1β介导的iNOS诱导。

p38MAPK对NF-κB的这一双向调控作用仍需做进一步研究。

5 结语
p38MAPK通路作为将细胞外刺激信号传递到细胞核的细胞内信号转导系统中的一条重要途径，是参与炎症反应调控的重要信号系统。

P38MAPK在炎症因子刺激肺泡上皮细胞、巨噬细胞表达iNOS、产生NO 的过程中起重要作用,这一作用可能与p38MAPK调控NF-κ B 的活化有关。

给予特异性的阻断剂, 在信号通路水平阻断和调控p38MAPK的表达和活性, 将可能成为气道炎症性疾病一条新的治疗途径。

参考文献
1 Haddad EB,Birrell M,Cluskie KM,et al. Role of p38 MAP kinase in LPS-induced airway inflammation in the rat.British Journal of Pharmacology,2001,132(8):1715-1724.
2 Lane C,Knight D,Burgess S,et al.Epithelial inducible nitric oxide synthase activity is the major determinant of nitric oxide concentration in exhaled breath. Thorax,2004,59(9):757–760.
3 Costa B,Conti S,Giagnoni G,et al.Therapeutic effect of the endogenous fatty acid amide ,palmitoylethanolamide ,in rat acute inflammation :inhibition of nitric oxide and cyclo-oxygenase systems. Br J Pharmacol,2002,137(4):413～420.
4 Ricciardolo FLM.Multiple roles of nitric oxide in the airways.Thorax,2003, 58(2):175-182.
5 Liaudet L,Soriano FG,Szabo C.Biology of nitric oxide signaling. Crit Care Med, 2000,28(4): 37-52.
6 Huabao Xiong,Chen Zhu,Fengling Li,et al. Inhibition of interleukin-12 p40 transcription and NF-κB activation by nitric oxide in murine macrophages and dendritic cells.J Biol
Chem,2004,279(11):10776–10783.
7 Takano H ,Lim HB,MiyabaraY, et al. Oral administration of L-arginine potentiates allergen-induced airway inflammation and expression of interleukin-5 in mice.J Pharmacol Exp Ther,1998,286(2):767-771.
8 Hanfang Zhang,Xingwu Teng,Snead C,et al. Non-NF-kB elements are required for full induction of the rat type II nitric oxide synthase in vascular smooth muscle cells. British Journal of Pharmacology,2000,130(2):270-278.
9 Matsumura M,Kakishita H,Suzuki M,etal.Dexamethasone suppresses iNOS gene expression by inhibiting NF-κB in vascular smooth muscle cells.Life Sci,2001, 69(9): 1067-1077.
10 Hammermann R,Dreissig MD,Mossner J,et al.Nuclear factor-kappaB mediates simultaneous induction of inducible nitric-oxide synthase and Up-regulation of the cationic amino acid transporter CAT-2B in rat alveolar macrophages. Mol Pharmacol, 2000,58(6):1294-1302.
11 Meldrum DR, Shames BD, Meng X, et al.Nitric oxide downregulates lung macrophage inflammatory cytokine production.Ann Thorac Surg,1998,66(2):313-317.
12 Koh Y,Kang JL,Park W,et al.Inhaled nitric oxide down regulates intrapulmonary nitric oxide production in lipopolysaccharide induced acute lung injury. Crit Care Med,2001,29(6):1169-1174.
13 Connelly L, Palacios-Callender M, Ameixa C,et al.Biphasic regulation of NF-kB activity underlies the pro-andAnti-inflammatory actions of nitric oxide. The Journal of Immunology,2001,166(6):3873-3881.
14Zhang N,Xu YJ,Zhang ZX,et al. Role of nitric oxide-nuclear factor kappaB signal pathway in functional expression of T lymphocytes from asthmatic patients .Zhonghua Nei Ke Za Zhi,2005,44(5):328-332.
15 Herlaar E , Brown Z. p38 MAPK signalling cascades in inflammatory disease. Mol Med Today,1999,5(10):439-447.
16 Nick JA,Avdi NJ,Gerwins P,et al. Activation of a p38 mitogen-activated protein kinase in human neutrophils by lipopolysaccharide.J Immunol,1996,156 (12):4867-4875.
17 Underwood DC,Osborn RR,Bochnowicz S,et al.SB 239063,a p38 MAPK inhibitor, reduces neutrophilia,inflammatory cytokines,MMP-9,and fibrosis in lung.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000,279(5):L895-L902.
18 Bannerman DD,Goldblum SE.Direct effects of endotoxin on the endothelium: barrier function and b Invest,1999,79(10):1181.
19 Hong Huang, Jane L. Rose, and Dale G. Hoyt. p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Mediates Synergistic Induction of Inducible Nitric-Oxide Synthase by Lipopolysaccharide and Interferon-γthrough Signal Transducer and Activator of Transcription 1 Ser727 Phosphorylation in Murine Aortic Endothelial Cells. Mol Pharmacol,2004,66(2):302-311.
20 LU Jiakai, YANG Zhihuan ,JIANG Jianxin, et al. Regulative effect of p38 MAPK on release of TNF alpha and NO from alveolar macrophages under endotoxin stimulation.Chin J Traumatol,2001,4(2):75-77.
21 Kan WH,Yan WS,Jiang Y,et al.Role of p38 mitogen activated protein kinase in lipopolysaccharide-induced expression of inducible nitric oxide synthase in human endothelial cells.Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao,2002,22(5):388-392.
22 Wang JY,Shum AY,Ho YJ,et al.Oxidative neurotoxicity in rat cerebral cortex neurons: synergistic effects of H2O2and NO on apoptosis involving activation of p38 mitogen-activated protein kinase and caspase-3.J Neurosci Res,2003,72(4):508- 519.
23 Browning DD,Windes ND,and Ye RD. Activation of p38 Mitogen-activated Protein Kinase by
Lipopolysaccharide in Human Neutrophils Requires Nitric Oxide-dependent cGMP Accumulation.J Biol Chem,1999,274(1):537-542.
24 Ghatan S,Larner S,Kinoshita Y,et al.P38 MAP kinase mediates bax translocation in nitric oxide-induced apoptosis in neurons.J Cell Biol,2000,150(2):335-347.
25 Maa SH,Wang CH,Lin CY,et al.Endogenous nitric oxide downregulates the Bcl-2 expression of eosinophils through mitogen-activated protein kinase in bronchial asthma.J Allergy Clin Immunol,2003,112(4):761-767.
26 Bhat NR,Feinstein DL,Qin Shen,et al.p38MAPK-mediated transcriptional activation of inducible nitric-oxide synthase in glial cells.J Biol Chem,2002,277(33):29584-29592.
27 Nick JA,Avdi NJ,Young SK,et al.Selective activation and functional significance of p38alpha mitogen-actvation protein kinase in lpopolysaccharide-stimulated neutrophils. J Clin Invest, 1999, 103(6):851-858.
28 Alpert D, Schwenger P, Han J, et al. Cell stress and MKK6b-mediated p38MAP kinase activation inhibit tumor necrosis factor-induced IkB phosphorylation and NF-kB activation. J Biol Chem,1999,274(32):22176–22183.
29 Lee JC, Layton JT, McDonnell PC,et al. A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis. Nature,1994,372(6508):739-746.
30 Zhonghong Guan, Baier LD, Morrison AR. p38 mitogen-activated protein kinase down-regulates nitric oxide and up-regulates prostaglandin E2 biosynthesis stimulated by interleukin-1beta.J Biol Chem,1997,272(12):8083-8089.。