血液线粒体DNA抽提试剂盒说明书

血液线粒体DNA抽提试剂盒说明书
近几年,从有报告暗示糖尿病、阿尔茨海默病和线粒体DNA(mtDNA)变异有关开始,mtDNA分析变得盛行1),2),3),4)。

可是，想要抽提高纯度mtDNA，需要繁杂的操作和很多的时间，不适合以多样品处理为目的的研究。

目前进行的mtDNA分析，从细胞中抽提total DNA时，产物中含有微量mtDNA与大量基因组DNA。

mtDNA 抽提WB试剂盒可短时间从全血中容易的抽提出高纯度mtDNA，适合多样品处理。

〔特点〕
Ⅰ. 简单操作，可短时间（约90分钟）抽提出mtDNA。

Ⅱ. 可从EDTA 处理血及肝素处理血中抽提出mtDNA。

Ⅲ. 抽提出的mtDNA混入了少量高纯度基因组DNA，可用于限制性内切酶处理或DNA扩增反应。

Ⅳ. 适合少量多样品的DNA扩增反应的预处理。

Ⅴ. 不使用苯酚、氯仿等有害剧毒溶剂。

〔内容〕
1) Leukocyte Isolation Solution 5.0 ml 1支
2) DNA Extraction SolutionⅠ 26.5 ml 1支
3) DNA Extraction SolutionⅡ(A) 1.3 ml 1支
4) DNA Extraction SolutionⅡ(B) 1.3 ml 1支
5) DNA Extraction SolutionⅢ 1.9 ml 1支
6) Sodium Iodide Solution 7.5 ml 1支
7) Washing Solution 50.0 ml 1支
〔储存方法〕2～10℃保存
〔除试剂盒外，实验所必备的东西〕
试剂
1) 异丙醇（特级，Code 166–04836）12.5 ml
2) TE缓冲液（基因工程学研究，Code 316–90025）适量
器具
1) 1.5 ml 微管（已灭菌）
2) 涡流搅拌器
3) 微量高速离心机（最大12,000×g）
4) 减压干燥机
〔使用方法〕
(1) 将100μl的人类新鲜血液放入微管中*1。

*1可使用经EDTA 处理的血液及肝素处理的血液，但请勿使用已溶血的血液。

(2) 加入200μl的Leukocyte Isolation Solution，将微管颠倒10次以上，充分混合*2。

*2混合的过程使白血球分离变得容易。

(3) 把微管静置于室温下15分钟，使成二层分离*3。

*3 上层有少量红血球浮游，也没有问题。

二层不分离的情况，请静置15分钟以上。

(4) 将含有白血球的上层液用移液管移到新的微管。

(5) 在室温情况下离心(500×g)10分钟后，使用移液器去除上清液。

(6) 加入500μl的DNA Extraction SolutionⅠ，经轻敲，颗粒悬浮*4。

*4 请避免涡流搅拌器等剧烈混合。

(7) 在室温情况下离心(500×g)10分钟后，使用移液器去除上清液。

(8) 重复一次步骤(6)及(7)。

(9) 加入50μl的DNA Extraction SolutionⅠ，经轻敲，颗粒悬浮。

(10) 50μl的DNA Extraction SolutionⅡ(A)及50μl的DNA Extraction SolutionⅡ(B)*5在另外的微管内混合(用的时候再调配)*6，将100μl这个混合液加入样品中，在涡流搅拌器中进行2～3次轻轻混合搅拌后, 放置在冰中5分钟。

*5如果DNA Extraction SolutionⅡ(B)产生沉淀，请用37℃的水，温热完全溶解后，在室温下冷却后使用。

*6 DNA Extraction SolutionⅡ(A)及(B)混合后，以2～10℃可以保存3周．
(11)加入75μl预先冰冷的DNA Extraction SolutionⅢ，用涡流搅拌器混合后，放置在冰中5分钟。

(12)以4℃离心(12,000×g)5分钟后，使用移液管将上清液移到新的微管。

(约200μl 的)*7
*7请注意移液管不要吸到沉淀（不需要采取全部上清）。

如果吸到茶褐色的沉淀，请再次离心，完全去除沉淀。

(13)加入300μl 的Sodium Iodide Solution 混合。

(14)加入500μl的异丙醇混合*8.
*8因为异丙醇的品质劣化，液有可能出现黄色着色，所以请使用特级品。

(15) 在室温情况下离心(12,000×g)10分钟后,去除上清液*9.
*9因为含有共沉淀剂，能视为颗粒。

(16)加入1 ml 的Washing Solution混合。

(17)在室温情况下离心(12,000×g)5分钟后，去除上清液。

(18)重复一次步骤(16)及(17)。

(19)颗粒(DNA) 减压干燥后，溶解于TE 缓冲液中*10.
*10最终得到的mtDNA混入了RNA，如要除去，请进行RNase处理（最后浓度为10μg/ml,在室温下反应1小时）。

〔故障诊断与解决〕。