阿霉素肾病模型中肾病蛋白、α—平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶

阿霉素肾病模型中肾病蛋白、α—平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶
—9表达的时相变化
目的研究阿霉素腎病模型不同时相中肾病蛋白（nephrin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶（MMP）-9表达变化。

方法采用间隔2周2次尾静脉注射阿霉素的方法复制大鼠阿霉素肾病模型，实验分对照组（正常大鼠28只）和模型组（阿霉素肾病大鼠28只），观察2、4、8、12周各项指标的变化，包括24 h尿蛋白、血浆白蛋白和总胆固醇的检测，采用Western-blot法检测肾皮质部nephrin的蛋白表达，采用荧光定量PCR检测肾组织α-SMA的表达，采用ELISA法检测血清MMP-9的表达。

结果阿霉素肾病大鼠模型组蛋白尿持续增加，12周末病理表现为肾小球节段性硬化。

Nephrin蛋白的表达2周时已出现减少，8周时明显减少，持续至12周时仍未见恢复，与尿蛋白定量呈负相关。

α-SMA mRNA的表达2周时开始增加，呈时间相关性递增，其表达与尿蛋白定量呈正相关。

血清中MMP-9的表达2周时出现显著减少，呈时间相关性递减，与24 h尿蛋白定量呈负相关。

结论通过间隔2周尾静脉注射阿霉素的方法复制阿霉素肾病动态进展模型，nephrin、α-SMA、MMP-9在各不同时相均参与肾病进展。

[Abstract] Objective To dynamically observe the expression of nephrin，α-SMA and MMP-9 in different pathological mechanism in Adriamycin-induced nephropathy rat model. Methods The rat Adriamycin nephrosis model was constructed by injecting Adriamycin 4 mg/kg into tail vein and 3.5 mg/kg two weeks later. 56 rats were devided into normal group and model group with 28 rats in each group. The blood and urinary indicators were detected at 2nd，4th，8th and 12th weeks while the pathological changes of the renal tissues were observed under light microscope. Protein expression of nephrin in cortex of kidney was detected by western blot. The mRNA expression of α-SMA in cortex of kidney was examined by RT-PCR. Serum MMP-9 was tested by ELISA. Results Proteinuria of adriamycin nephrosis rats in model group increased continuesly，pathology was glomerular sclerosis of segmental over the 12 weekend. Nephrin protein expression had been reduced at 2 weeks，8 weeks decreased significantly，while continuing to 12 weeks with no recovery，and it was negatively correlated with urinary protein quantitative. Alpha SMA mRNA expression began to increase in 2 weeks with the time correlation increasing，and its expression and quantitative urine protein were positively correlated. Serum in the expression of MMP - 9 in 2 weeks，there was a significant decrease，with the time correlation diminishing，and it was negatively correlated with 24 h urine protein quantitative. Conclusion Through the method of interval of 2 weeks tail intravenous injection of Adriamycin replication dynamic progress model of Adriamycin nephrosis nephrin，alpha SMA，MMP - 9 in each phase are involved in kidney disease progress at the same time.[Key words] Adriamycin nephropathy；Nephrin；α-SMA；MMP-9
肾病综合征作为儿科常见疾病，各种因素决定着它的预后，包括临床类型、病理改变、治疗效果等，然而当长期蛋白尿得不到控制时，无论哪一种病理类型的肾病综合征都将不可避免地走向慢性化，临床上可见到微小病变患者进展为局灶节段性肾小球硬化便是如此。

一段时间以来，足细胞的形态功能变化在肾小球硬化中的作用机制研究成为焦点，然而更多研究证实肾小球硬化绝不仅仅是足细胞的作用，众多因素参与其中，形成错综复杂的网络[1-2]。

阿霉素肾病模型始出现于20世纪80年代，由于其稳定的生物学特性而在肾脏病研究领域广泛应用，近年来有研究者采用间隔2周尾静脉注射阿霉素的方法模拟出局灶节段性肾小球硬化模型[3]。

本实验通过该模型模拟出与人类微小病变进展至局灶节段性肾小球硬化相似的病程，观察不同时相中肾病蛋白（nephrin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的动态变化，揭示各相关因素在肾小球硬化中的相互作用。

1 材料与方法
1.1 动物与试剂
同批次健康清洁级Spraque-Dawley（SD）雄性大鼠56只，体重（230±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司（批号：2007000517870）。

盐酸阿霉素（生理盐水稀释2 mg/mL，法玛西亚公司，意大利，批号：9QL0011），HRP-标记的羊抗小鼠二抗、小鼠抗大鼠β-actin（Abcam公司，美国），nephrin一抗（Abcam 公司，美国），MMP-9检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。

1.2 方法
1.2.1 模型制作与分组大鼠适应性饲养1周，称体重，检测24 h尿蛋白阴性后按照随机数字表分为两组。

对照组28只，模型组28只。

实验期间自由进水，饮食。

模型组大鼠尾静脉各注射阿霉素 4 mg/kg，2周后再次注射阿霉素 3.5 mg/kg，对照组大鼠分别于相同时间尾静脉注射等量生理盐水。

从第2次注射后连续观察12周末。

1.2.2 大鼠尿蛋白、血生化的检测各组分别于阿霉素注射前1天，注射后2、4、8、12周末用代谢笼收集24 h尿液，双缩尿法测定24 h尿蛋白定量。

每次尿液采集结束后对照组及模型组随机取大鼠各7只水合氯醛麻醉后处死，心脏采血3 mL，全自动生化分析仪检测血清白蛋白、总胆固醇、肌酐。

1.2.3 腎组织病理观察甲醛固定的部分肾皮质常规石蜡包埋，切片，作HE 和Masson染色，光镜下观察肾小球基本病理改变。

戊二醛固定的部分肾皮质，送检至南京医科大学大型仪器设备中心制备切片，作透射电镜观察。

1.2.4 Western blot 法检测肾皮质部nephrin表达用蛋白提取液RIPA（含蛋白酶抑制剂PMSF）提取肾皮质组织总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。

每组加100 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭120 min，分别加入nephrin（1∶5000）和β-actin（1∶1000）一抗4℃孵育过夜，以HRP 标
记的IgG室温孵育90 min，洗膜后加入发光显色液显色，X光片显影、定影。

以β-actin作为内参，使用Image J软件分析灰度值。

1.2.5 逆转录聚合酶链反应检测肾组织α-SMA mRNA的表达用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取肾组织总RNA，紫外分光光度仪测其纯度及含量。

在反转录酶催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下进行扩增。

聚合酶链反应引物由美国Invitrogen公司上海分公司合成，引物序列：GAPDH：5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’，5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’，产物149 bp，α-SMA：5’-CTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3’，5’-GCATTT GCGGTGGACAATGGA-3′产物为374 bp。

PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳、凝胶图像扫描系统成像并进行灰度扫描，以密度代表其表达量，用GAPDH的表达量校正，将两者吸光度的相对量进行分析。

重复3次独立的半定量PCR全过程。

1.2.6 ELISA法检测大鼠血清MMP-9含量取大鼠血清40 μL，按说明书要求操作，按浓度梯度稀释标准品后取50 μL依次加入空白微孔中，各样品取40 μL 加入抗- MMP-9抗体10 μL，链酶亲和素-HRP 50 μL，轻轻晃动混匀。

盖上封板膜后，37℃温育60 min。

洗涤后显色，37℃避光反应15 min，终止反应。

酶标仪测定450 nm处OD值。

根据标准曲线计算样本含量。

1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间差异比较进行单因素方差分析（ANOV A），方差不齐时采用Dunnett T3检验，相关性采用Spearman相关分析法。

两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组大鼠尿蛋白、血生化的检测
模型组2周时即出现大量蛋白尿，随着时间的进展，蛋白尿持续增加，各时间点尿蛋白与对照组比较差异有统计学意义（均P < 0.01）。

见表1。

模型组2周时出现血浆白蛋白降低及总胆固醇轻度升高，随着时间的进展，血浆白蛋白持续降低，总胆固醇持续升高，4周起各时间点血浆白蛋白、总胆固醇及肌酐与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

白蛋白降低与前一时间段组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

见表2。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量的动态变化（mg/24 h，x±s，n=28）2.2 肾脏病理形态学变化
光镜及电镜观察染色标本肾小球的形态，实验中正常对照组肾小球整体变化不大，肾病组第2周电镜可见肾小球的体积增大，足突间裂隙消失，足突变形、融合或消失；肾病组第4周时，足细胞肿胀明显，并有小新月体形成及球囊壁纤
维化；肾病组第8周，系膜细胞轻度增生，部分大鼠有肾小球毛细血管襻阶段性硬化伴肾小管萎缩、系膜基质增生。

肾病组第12周，肾小球局灶阶段性硬化明显，肾小管萎缩，系膜细胞和系膜基质增生明显。

见图1。

图1 肾组织病理学变化（光镜，400×）
2.3 肾皮质部nephrin蛋白的表达变化
实验中，nephrin蛋白的相对表达量随时间进展逐渐减少，与对照组相比差异有高度统计学意义（P < 0.01）。

各时间点与前一时间点相比差异均有统计学意义（P < 0.05）。

见图2。

2.4 α-SMA mRNA在肾组织表达的变化
与对照组相比，α-SMA mRNA的表达均明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01），随模型时间的推移，α-SMA mRNA的表达逐渐升高，每组与前一时间段相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。

见图3。

2.5 血清MMP-9表达情况
血清MMP-9的表达自2周起即出现下降，8周时显著下降，与对照组相比，差异有计学意义（P < 0.05），随模型时间推移，MMP-9的表达呈持续下降趋势，每组与前一时间段相比差异有统计学意义（P < 0.05）。

见图4。

2.6 相关性分析
Nephrin的表达与24 h尿蛋白定量呈显著性负相关（r=-0.529，P < 0.05），血清MMP-9的表达量与24 h尿蛋白定量呈显著性负相关（r=-0.454，P < 0.05），α-SMA mRNA的表达与nephrin（r=-0.858，P < 0.01）及MMP-9（r=-0.686，P < 0.01）均呈显著负相关，nephrin的表达与MMP-9（r=-0.872，P < 0.01）则呈显著正相关。

3 讨论
在肾脏纤维化的过程中，经典的观念认为肾脏的纤维化是细胞外基质（ECM）大量聚积导致肾脏广泛纤维化所致，近年来，大量研究证实包括足细胞、系膜细胞、上皮细胞、小管细胞在内的肾脏固有细胞的变化均参与肾脏纤维化。

Kim等[4]研究证实足细胞减少是肾小球硬化的基础，而足细胞的损傷犹如连锁反应般影响着其他足细胞，从而加速肾小球硬化的形成[5-6]。

体内外多项研究表明系膜细胞在肾小球硬化过程中起重要作用，Weigert等[7]及Brosius等[8]研究发现糖尿病肾病纤维化过程中，系膜基质降解减少固然是重要环节，系膜细胞也独立的发挥着影响糖摄取及糖代谢导致肾脏纤维化的作用。

肾小管上皮细胞经历多重生物学改变获得间充质细胞表型的过程称为上皮细胞间充质转化（EMT），Iwano等[9]首次应用近端小管上皮细胞遗传标记小鼠证实，单侧输尿
管梗阻（UUO）模型小鼠小管间质区成纤维细胞中36%来源于近端小管，从而有力地说明EMT是炎症环境下肾脏固有细胞发生的重要生物学事件。

因此，肾脏纤维化是一个复杂多因素参与的过程，最重要的就是肾脏固有细胞及结缔组织细胞等，而其作为慢性肾脏病（CKD）进展至终末期肾脏疾病（ESRD）的共同病理表现，其逆转机制一直成为众多学者研究的焦点。

然而至今仍未发现关键性的时机及关键性的途径。

本实验中，笔者采用了2次尾静脉注射多柔比星成功建立了肾小球硬化模型，该模型成功模拟了肾脏疾病的进展过程，与临床所见的慢性肾脏病过程极为相似。

在模型中，第4周出现系膜细胞增生，新月体形成，8周时出现毛细血管袢阶段性硬化，12周时肾小球硬化超过50%，提示第8周为肾小球硬化期。

Nephrin是位于足细胞裂孔膜区域的一种跨膜糖蛋白，是第一个被确定的肾小球滤过屏障结构蛋白分子，其正常表达对维护足细胞功能结构的完整性及对维持裂孔膜结构和功能起重要作用，其分布和表达的异常已被证实与多种先天性及获得性蛋白尿相关[10-11]。

本实验研究发现其在第2周时已开始发生变化，8周时变化最为显著，直至12周时这种下降趋势仍未见扭转。

α-SMA为真核细胞的一种细胞骨架蛋白，参与构成微丝结构，是肌成纤维细胞的特征蛋白，被普遍作为检测肾脏固有细胞向肌成纤维细胞表型转化的一项指标[12-13]。

本研究发现，α-SMA的表达在第2周时开始升高，随病程不断进展，至12周时居高不下。

MMPs是ECM降解的主要酶系，MMP-9是降解Ⅳ型胶原的最主要成员之一[14-15]。

本实验中MMP-9的表达也自第2周起下降，持续下降趋势至12周时未恢复。

MMP-9的产生用来消除基质的聚积，然而病变却仍不可避免的进展，说明在疾病过程中其他正性作用更为突出，机体自身的免疫应答在此过程中发生了变化，受到抑制从而使疾病不可逆。

综上所述，本研究从动物整体水平上发现，nephrin蛋白的表达减少最早发生，MMP-9及α-SMA虽也在早期即开始出现变化，但在肾小球硬化期变化更为显著，由此为寻找逆转肾脏纤维化的关键时间点找到证据。

既然肾脏纤维化是一个多种因素共同参与的疾病，原因多样复杂，且多多少少存在着相互促进或抑制的关联，因此在寻求逆转的肾脏纤维化的方法时需要多重考虑多靶点共同治疗。

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（本文編辑：卫轲）。