提取RNA及PCR步骤

一、提取组织RNA
1．准备好冰盒、1.5mlEP管（无RNA酶)、剪刀及镊子（需消毒,再用灭菌纯水和DEPC水洗净）、钻头、灭菌纯水等。

2. 取出冻存管,剪取约0.5cm放于EP管。

3. 即刻加1ml trizol，剪碎至无可见微粒，静置5—10min
4。

加0.2ml 氯仿,盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s， 15—30℃静置2—3min
5. 离心12,000g*15min， 2-8℃
6。

EP管内分三层,取上层液相置于新EP管
7。

加0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀,15—30℃静置10min
8。

离心12,000g＊10mim, 2—8℃
9。

弃上清(不用吸净残液），加1ml 75％乙醇清洗沉淀(乙醇用前需4℃预冷)
10。

离心10000/7500g＊5min, 2—8℃
11。

去上清（需吸净残液），干燥RNA（超净台内风干至白色变透明状，约1h以上)，加10—12ul DEPC 水解（约1h以上),测浓度,—80℃保存。

PS:
1.所用枪头、EP管、DEPC水、纯水、剪刀、镊子均需灭菌。

2。

75%无水乙醇用前需4℃预冷。

3．若最后提取出的RNA量多，可加30ulDEPC水溶解;若难以溶解，可置于55℃水浴加热。

4．破碎:取组织勿过多，否则难以破碎，亦难以提取RNA；一个样品破碎过后需清洗，顺序为：酒精棉球擦洗→DEPC水洗→拆分清理→纯水洗→棉球吸去钻头残液。

5。

破碎仪的使用：打开前先保证已调于低档，将钻头浸没于样品中，切忌在空气中空转，从低到高慢调，同时上下轻移样品,注意力度控制，避免液体飞溅误伤;同时注意听破碎时的声音，若有尖锐声音发出,说明有异物卡住钻头，需停止查看。

二、提取细胞RNA
1。

细胞加1ml trizol 裂解5min, 15—30℃
2。

加0.2ml 氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s, 15—30℃静置2-3min
其余步骤参见提取组织RNA的第5步开始
PS：
1。

新EP管需用无RNA酶EP管。

2. 操作过程需时刻注意避免污染,EP管取放时勿碰到内壁及管口,每步操作前需适时擦拭双手及枪管。

3．RNA勿照紫外。

4．DEPC水量较关键，需保证RNA充分均匀融解，若可用肉眼看到白点，可多加至20ul。

三、测RNA浓度:
准备96孔板→开盖，盖子朝天放→加98ulEDPC→预读（setting：OD值 260；选中区域；选“预读") →“Read" →结果复制→拿出孔板,再加2ulRNA→直接“READ” →复制结果(复制后的结果与软件上的不同，此为已经相减后的数据）→重设条件（setting：OD值 260 280;选中区域；“Normal”；“Delete”；“OK”）→“READ” →复制结果→数据处理:
C RNA(ug/ml）=“Normal”值—预读值
C RNA（ug/ul）=50（稀释倍数）＊40(OD值）＊1/1000＊ C RNA（ug/ml)=2＊ C RNA（ug/ml)
V RNA=1ug（可变)/ C RNA
V H2O=V(总体积由说明书得）—V RNA
PS：
1.C260/ C280的比值意义范围为1.8—2。

0,小于1.8可能是蛋白含量较多,大于
2.0可能是DNA含量较多2．往孔板加液时，勿使枪头顶端碰触孔板内壁，以防损伤内壁包被液
3. 样品多的话，不用分别加入，可先配总量，再分装
四．反转录PCR
1．加:1ul oligo（dT)
1ng—5ug 总RNA
1ul 10mMdNTP混合物
灭菌水（DEPC）加至11ul(12—1）
2．混合物：放入PCR仪→65℃，5min→结束后迅速移至冰上
3．加：4ul 5＊buffer
2ul 0.1M DTT
轻混匀→PCR→37℃, 2min
4。

室温下加入1ul M-MLV→轻混匀（防气泡）
5．PCR仪：37℃，50min + 70℃,15min + 4℃， 5min
PS：1。

冰上操作，严格遵守无RNA酶操作
2．加液时，枪头贴近液面快速打出液体，提离液面后放松
五．Q—PCR
1。

加液：SYBR 5ul
（ ROX 0。

2ul（eppendorf AG PCR无需加此物））
Primer 0。

2﹢0.2ul
cDNA 0.5ul
H2O 4.1ul
2.离心：
A、8联管:样品对称离心→打开离心机总开关→打开盖子→对称放入样品→盖面上的白点对准机孔边的标签盖好→按“启动" →转速升到“1100”左右→按“停止" →等转速降至“60”左右开盖取出→仪器复位
B、96孔板：水平离心，3000rpm,3-5min
PS:加液或转运样品时均需用到冰盒.
3. 实时荧光定量PCR的使用（eppendorf AG PCR）：
A．仪器结构：上部为荧光检测仪，下部为热循环仪;
银质模块,光源为LED;
2个光电倍增管（CPM检测器）；
4通道检测：520nm，550nm,580nm,608nm；
B. 备注：①运行前需预热15min,PCR仪可过夜运行。

②此仪器需3个月校正一次，用DDwater（去离子水)20ul，默认校正温度为60℃。

③默认热启动，每分钟升温8℃,可1次自检/15min。

④关于指示灯：闪烁表明在运行;亮绿灯表明在保温；亮桔灯表明在自检。

⑤软件登录密码为E/e;连续开启软件,间隔时间为1-2s；此仪器无需用ROX作为校正荧光.
⑥此程序可根据已完成循环的荧光信号(原始数据）进行数据分析，在反应结束前即可观
察结果。

⑦设置条件时一般选择相对定量,即蓝色桶状图标；红色桶状图标为绝对定量。

C．软件操作：
开启电脑→开PCR仪→双击软件图标→口令“E/e” →点击软件界面上端菜单左2进入操作界面→建立用户：点击上左6,选第一个,点击进入设置（选择管理员用户）→等待指示灯由黄变绿→进入界面“plate layout”进行设置,“Filter 520nm"：“SYBR”；“Sample Vol”:上样体
积;“background”:“Axygen 8—strips"（80管）→放入样品(记住安放顺序，盖紧盖子且勿污染盖面，轻放样品以防产生气泡或产生内壁残液）→点住鼠标左键，选定样品区域，点击右键,选择“unkown”(相对定量），标记引物名称→选定内参区域,点击右键，选择“Standard"（相对定量），标记内参名称→转换界面进入“PCR Program”，设置反应体系（鼠标移至目标区域，点击右键，选“Insert”，插入所需项）；选中下方的“TSP Heated Lid"及“Impulse";“Temp。

Mode”：“standard ”→设置完后需保存，在点击“运行"
反应体系：
95℃ 2min
94℃ 15s↘40*
（荧)60℃ 25s↗
溶解曲线（点击鼠标右键→“Insert” →“Me lting”)：
95℃/94 15s
60℃ 15s
荧 20min
95℃/94 15s
D．结果分析:
调节基线，选择阈值（标准：同样品两孔之间的阈值差值△≤0。

35)→取样品及其副孔的阈值平均值→平均值-相应内参的阈值=相对值→得出的最大相对值逐一去减其他的相对值→得出的结果设为X，运用公式Power(2，x)得出最终的数据。