日本血吸虫Argonaute蛋白...
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华中农业大学 2010 届硕士学位论文
2.2.6 5′RACE 套式 PCR 反应扩增 SjAGO2、SjAGO3 基因 5′末端 .................... 14 2.2.7 全长序列拼接 .................................................................................................. 15 2.2.8 AGO2、AGO3 重组质粒的构建 ..................................................................... 16 2.2.9 SDS-PAGE 分析重组蛋白在大肠杆菌中表达时相........................................ 17 2.2.10 重组蛋白大肠杆菌中大量表达 .................................................................... 18 2.2.11 重组蛋白的纯化 ............................................................................................ 18 2.2.12 SjAGO2、SjAGO3 蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体 ............................ 18 2.2.13 Western blot 分析血吸虫全虫蛋白与多克隆抗体特异性反应 ................... 19 2.2.14 实时定量分析 SjAGO3 在血吸虫不同时期的转录情况 ............................ 20 2.2.15 Western blot 分析 SjAGO2 和 SjAGO3 蛋白不同时期表达情况以及雌雄虫 中表达差异 ................................................................................................................ 20 2.3 结果与分析 ............................................................................................................. 21 2.3.1 SjAGO2、SjAGO3 RACE 结果....................................................................... 21 2.3.2 SjAGO2、SjAGO3 蛋白的全长 cDNA 及生物信息学分析.......................... 23 2.3.3 AGO2、AGO3 重组蛋白表达 ......................................................................... 30 2.3.4 ELISA 检测不同时间抗 AGO2、AGO3 IgG 变化情况 ................................ 34 2.3.5 Western blot 分析多克隆抗体和日本血吸虫全虫蛋白特异结合 .................. 34 2.3.6 AGO3 不同时期转录分析................................................................................ 35 2.3.7 AGO2、AGO3 不同时期以及雌雄虫表达差异分析 ..................................... 36 2.4 讨论 ......................................................................................................................... 37 小 结 ............................................................................................................................... 39 参考文献 ........................................................................................................................... 40 致 谢 ............................................................................................................................... 45 硕士期间发表的文章 ....................................................................................................... 46 附录 1 ................................................................................................................................ 47
日本血吸虫 Argonaute 蛋白(AGO)家族成员 AGO2 和 AGO3 的初步研究
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ目录
摘 要 ..................................................................................................................................I Abstract............................................................................................................................... II 缩略词 ............................................................................................................................... IV 第一章 文献综述 ............................................................................................................. 1
1.4.1 虫源性疫苗 ........................................................................................................ 4 1.4.2 合成肽疫苗 ........................................................................................................ 4 1.4.3 抗独特型抗体疫苗 ............................................................................................ 4 1.4.4 基因工程疫苗与核酸疫苗 ................................................................................ 4 1.5 展望 ........................................................................................................................... 6 1.6 Argonaute 蛋白(AGO)的研究 ................................................................................... 7 1.6.1 AGO 对 miRNA 和 siRNA 的选择性 ................................................................ 7 1.6.2 AGO 与 Dicer 之间的作用 ................................................................................. 8 1.7 小结 ........................................................................................................................... 8 第二章 日本血吸虫 Argonaute 蛋白(AGO)家族成员 AGO2 和 AGO3 的研究............ 9 2.1 材料 ........................................................................................................................... 9 2.1.1 主要试剂和酶 .................................................................................................... 9 2.1.2 菌种和实验动物 ................................................................................................ 9 2.1.3 实验仪器 .......................................................................................................... 10 2.2 实验方法 ................................................................................................................. 10 2. 2.1 RNA 提取......................................................................................................... 10 2.2.2 3′RACE 和 5′RACE 基因特异引物 ................................................................ 11 2.2.3 3′RACE 反应所需 RNA 的处理 ...................................................................... 11 2.2.4 3′RACE 套式 PCR 反应扩增 SjAGO2、SjAGO3 基因 3′末端 .................... 12 2.2.5 5′RACE 反应所需 RNA 的处理 ...................................................................... 13
1.1 日本血吸虫及其生活史 ........................................................................................... 1 1.2 血吸虫的危害 ........................................................................................................... 2 1.3 日本血吸虫在我国流行及防治 ............................................................................... 3 1.4 血吸虫疫苗研究现状 ............................................................................................... 3
华中农业大学 2010 届硕士学位论文
2.2.6 5′RACE 套式 PCR 反应扩增 SjAGO2、SjAGO3 基因 5′末端 .................... 14 2.2.7 全长序列拼接 .................................................................................................. 15 2.2.8 AGO2、AGO3 重组质粒的构建 ..................................................................... 16 2.2.9 SDS-PAGE 分析重组蛋白在大肠杆菌中表达时相........................................ 17 2.2.10 重组蛋白大肠杆菌中大量表达 .................................................................... 18 2.2.11 重组蛋白的纯化 ............................................................................................ 18 2.2.12 SjAGO2、SjAGO3 蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体 ............................ 18 2.2.13 Western blot 分析血吸虫全虫蛋白与多克隆抗体特异性反应 ................... 19 2.2.14 实时定量分析 SjAGO3 在血吸虫不同时期的转录情况 ............................ 20 2.2.15 Western blot 分析 SjAGO2 和 SjAGO3 蛋白不同时期表达情况以及雌雄虫 中表达差异 ................................................................................................................ 20 2.3 结果与分析 ............................................................................................................. 21 2.3.1 SjAGO2、SjAGO3 RACE 结果....................................................................... 21 2.3.2 SjAGO2、SjAGO3 蛋白的全长 cDNA 及生物信息学分析.......................... 23 2.3.3 AGO2、AGO3 重组蛋白表达 ......................................................................... 30 2.3.4 ELISA 检测不同时间抗 AGO2、AGO3 IgG 变化情况 ................................ 34 2.3.5 Western blot 分析多克隆抗体和日本血吸虫全虫蛋白特异结合 .................. 34 2.3.6 AGO3 不同时期转录分析................................................................................ 35 2.3.7 AGO2、AGO3 不同时期以及雌雄虫表达差异分析 ..................................... 36 2.4 讨论 ......................................................................................................................... 37 小 结 ............................................................................................................................... 39 参考文献 ........................................................................................................................... 40 致 谢 ............................................................................................................................... 45 硕士期间发表的文章 ....................................................................................................... 46 附录 1 ................................................................................................................................ 47
日本血吸虫 Argonaute 蛋白(AGO)家族成员 AGO2 和 AGO3 的初步研究
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ目录
摘 要 ..................................................................................................................................I Abstract............................................................................................................................... II 缩略词 ............................................................................................................................... IV 第一章 文献综述 ............................................................................................................. 1
1.4.1 虫源性疫苗 ........................................................................................................ 4 1.4.2 合成肽疫苗 ........................................................................................................ 4 1.4.3 抗独特型抗体疫苗 ............................................................................................ 4 1.4.4 基因工程疫苗与核酸疫苗 ................................................................................ 4 1.5 展望 ........................................................................................................................... 6 1.6 Argonaute 蛋白(AGO)的研究 ................................................................................... 7 1.6.1 AGO 对 miRNA 和 siRNA 的选择性 ................................................................ 7 1.6.2 AGO 与 Dicer 之间的作用 ................................................................................. 8 1.7 小结 ........................................................................................................................... 8 第二章 日本血吸虫 Argonaute 蛋白(AGO)家族成员 AGO2 和 AGO3 的研究............ 9 2.1 材料 ........................................................................................................................... 9 2.1.1 主要试剂和酶 .................................................................................................... 9 2.1.2 菌种和实验动物 ................................................................................................ 9 2.1.3 实验仪器 .......................................................................................................... 10 2.2 实验方法 ................................................................................................................. 10 2. 2.1 RNA 提取......................................................................................................... 10 2.2.2 3′RACE 和 5′RACE 基因特异引物 ................................................................ 11 2.2.3 3′RACE 反应所需 RNA 的处理 ...................................................................... 11 2.2.4 3′RACE 套式 PCR 反应扩增 SjAGO2、SjAGO3 基因 3′末端 .................... 12 2.2.5 5′RACE 反应所需 RNA 的处理 ...................................................................... 13
1.1 日本血吸虫及其生活史 ........................................................................................... 1 1.2 血吸虫的危害 ........................................................................................................... 2 1.3 日本血吸虫在我国流行及防治 ............................................................................... 3 1.4 血吸虫疫苗研究现状 ............................................................................................... 3