5-吲哚甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析

5-吲哚甲基海因及其工程菌转化产物的高效液相色谱分析
摘要通过RP-HPLC同时检测酶水解反应前后底物5-吲哚甲基海因及产物D-氨甲酰-N-色氨酸的含量变化,不仅可以检测海因酶的活性,还能分析酶反应过程的转化效率。

采用Merck公司的Purospher STAR RP-C18e色谱柱(4.6 mm×250.0 mm,5 μm),以乙腈-20 mmoL/L磷酸二氢钾缓冲液(体积比25∶75)为流动相,磷酸调pH值为3.0,流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃,检测波长为220 nm,于10 min内很好地实现了各组分的分离。

采用外标法进行定量分析,D-色氨酸、5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的线性范围分别是0.10~1.00 mg/mL(r=0.999 1)、0.20~2.00 mg/mL(r=0.998 9)、0.20~2.00 mg/mL(r=0.998 9);酶反应体系中5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的加标回收率分别为99.3%~100.2%和98.0%~99.3%,精密度分别为0.51%~0.87%和0.43%~0.94%。

试验结果表明该法快速简便、准确可靠。

关键词高效液相色谱;5-吲哚甲基海因;D-氨甲酰-N-色氨酸;D-色氨酸
HighPerformanceLiquidChromatographicAnalysisof5-(3-Indolylmethyl) hydantoinandItsProductsConvertedbyEngineeredBacteria
QIAN KaiXU Lin*YAN Ming
(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing Jiangsu 210009)
AbstractThe HPLC method was used to determine the concentrations of substrate 5-(3-Indolylmethyl)hydantoin,intermediate product N-carbamyl-D-Tryptophan and product D-Tryptophan in the reaction solution. The sample was determined using a Purospher STAR RP-C18e column(4.6 mm×250.0 mm,5 μm particle size)at the temperature of 30 ℃with the mobile phase of acetonitrile-20mmoL/L Sodium acetate(25∶75 by volume)which adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm.Under these conditions,the components in the reaction system were separated completely within 10 min. A good linear relationship was obtained by employing external standard method for quantitative analysis. The linear calibration ranges for the three target analytes were 0.10~1.00 mg/mL(r=0.999 1),0.20~2.00 mg/mL(r=0.998 9)and 0.20~2.00 mg/mL(r=0.998 9),respectively. The recoveries of the analytes from spiking experiments were 99.3%~102.0% and 98.0%~99.3%,respectively,with the relative standard deviation being 0.51%~0.87% and 0.43%~0.94%,respectively. The results showed that the method was rapid,convenient and accurate.
Key
wordsHPLC;5-(3-Indolylmethyl)hydantoin;N-carbamyl-D-Tryptophan;D-Tryptophan
海因酶是能够催化水解海因及其衍生物内酰胺键的一种环酰胺酶(EC 3.5.2)。

根据海因酶作用底物的特异性和产物的光学活性的不同,可以将海因酶分为L-型、D-型和DL-型。

海因酶在工业上的应用价值主要是用来生产L-型和D-型氨基酸,其作用机理是在L-型或D-型海因酶的催化作用下,使5′-单取代海因开环形成相应的L-型或D-型氨甲酰类氨基酸产物,进而通过化学或酶促降解反应生成L-型或D-型氨基酸。

非天然D-氨基酸及其衍生物是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂、杀虫剂以及拟除虫菊酯的重要中间体[1-2],特别是作为半合成抗生素的侧链原料,在医药领域具有十分广泛的应用价值。

利用海因酶法制备D-色氨酸具有光学纯度高、环境污染少、反应温和、操作简单、成本低廉等优点,并能实现一些化学合成难以进行的反应,日益受到国内外学术界与产业界的关注[3-7]。

随着当代生物技术的发展,基因工程、细胞工程、酶工程等新技术的注入,微生物转化的发展已经具有了高度的研究价值以及广阔的实际应用前景。

在海因酶法催化合成D-色氨酸的过程中,首先以5-吲哚甲基海因为前体,经D-海因酶(DHase)催化其开环水解生成相应的D-氨甲酰-N-色氨酸,然后在D-氨甲酰基氨基酸水解酶(Dcase)的催化下生成D-色氨酸。

为了更好地开展海因酶法制备D-色基酸的研究,有必要建立一种可以同时测定酶转化液中海因及其转化产物和中间产物的检测方法,以便更好地研究上述2个关键酶的催化机制和催化效果,进而及时掌握并调控整个反应的进程。

现有的5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的检测方法多为光谱学分析方法或质谱法[8],检测D-色基酸的方法多为比色和层析法等。

这些方法在海因酶法制备D-色基酸的研究检测过程中,不能满足监控整个反应进程的需要。

随着液相色谱技术的发展和研究,采用高效液相色谱(HPLC)对海因和氨甲酰类氨基酸进行分析的方法逐渐成熟[9-10],但关于5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的HPLC检测方法还鲜见报道。

本文建立的高效液相色谱法,不仅能准确测定5-吲哚甲基海因和D-氨甲酰-N-色氨酸的含量,且产物D-色氨酸也能同时得到分离和测定。

该方法能够快速完成酶催化反应中底物和产物的定量分析,为生产和研究海因及其酶转化产物提供良好的检测和分析平台。

1材料与方法
1.1试验仪器与试剂
仪器主要有:戴安UltiMate 3000液相色谱仪,配有戴安LPG-3400溶剂泵;戴安
VWD-3400紫外可调波长检测器;戴安WPS-3000SL自动进样器及Chromeleon数据处理软件。

试剂主要有:D-氨甲酰-N-色氨酸、5-吲哚甲基海因、D-色氨酸均由南京工业大学生化重点实验室提供(纯度大于99.5%);乙腈,HPLC级,Tedia Company;水均为二次蒸馏水;磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及其他试剂均为分析纯。

工程菌Rosetta pET-HyuH 由南京工业大学生化重点实验室构建保存。

1.2色谱条件
色谱柱:Merck Purospher STAR RP-C18e(4.6 mm×250.0 mm,5 μm);流动相:乙腈-20 mmoL/L磷酸二氢钾(体积比25∶75),用磷酸调pH值为 3.0;流速为 1.0 mL/min;检测波长为220 nm;柱温为30 ℃,进样量为10 μL。

1.3标准溶液的配制
准确称取D-色氨酸、D-氨甲酰-N-色氨酸、5-吲哚甲基海因标准品各0.01 g,分别加入适量的0.05 mmoL/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液(pH值8.0),然后与等比例的乙醇混合溶解,最后用10 mL容量瓶定容。

用移液枪分别从上述D-色氨酸、D-氨甲酰-N-色氨酸、5-吲哚甲基海因的标品溶液中吸取1、2、2 mL到新的容量瓶,然后用0.05 mmoL/L pH值8.0的磷酸缓冲-乙腈(1∶1)稀释定容至10 mL作为标准溶液,使混合液中D-色氨酸、D-氨甲酰-N-色氨酸、5-吲哚甲基海因的质量浓度分别为0.1、0.2、0.2 g/L。

1.4样品的制备
接种工程菌Rosetta pET-HyuH于5 mL含100 μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL 氯霉素的LB培养基,37 ℃、200 r/min摇床培养12 h,按2%的接种量转接于30 mL 发酵培养基,培养2 h后加入微量诱导剂于16 ℃、200 r/min诱导培养16 h,离心收集菌体。

取适量菌体Rosetta pET-HyuH,加入质量浓度为1 g/L的底物——5-吲哚甲基海因(0.05 moL/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液,pH值8.0)充分混匀,置于50 ℃水浴摇床反应,依次取反应时间为0.5、1.0、2.0 h的酶转化液,每次取500 μL,再加入500 μL等体积的乙醇稀释,12 000 r/min离心5 min,取上清液,经0.22 μm的尼龙膜过滤后供HPLC分析。

2结果与分析
2.1检测波长的确定
用移液枪吸取100 μL标准溶液稀释至3 mL,用VWD-3400型紫外可见分光光度计(波长范围190~900 nm)对稀释后的标准样品进行扫描,发现在210 nm附近有较明显的吸收峰,用戴安UltiMate 3000在上述有吸收峰的波长下分别进样2 μL 检测,发现在220 nm处的检测峰面积和峰高最大、最佳,故选用波长220 nm作为检测波长。

各物质在不同检测波长的响应值如表1所示。

2.2流动相的选择
由于乙腈在220 nm的低波长下噪音小,所以背景干扰小于其他有机溶剂,且洗脱能力强,故选用乙腈/水系统作为流动相。

按照乙腈浓度的不同配比从5%到40%,采用乙腈磷酸二氢钾流动相,磷酸调pH值为3.0,流速为1.0 mL/min。

在检测波长为220 nm、柱温为30 ℃的液相条件下分别对标准溶液进行检测,发现当乙腈浓度低于15%时,D-氨甲酰-N-色氨酸和5-吲哚甲基海因的保留时间十分接近,不能将各个组分很好地分离,且分析时间较长。

为了缩短分析时间,逐步提高乙腈的浓度,结果保留时间明显缩短,而且分离效果也得到改善,最佳浓度配比为25%(图1)。

但当乙腈浓度超过30%时,由于出峰时间太快,不利于各组分的分离。

2.3pH值的影响
为了调整各色谱峰的间距和峰形,进一步提高柱效和测量的精确度,用磷酸分别调节乙腈-20 mmoL/L磷酸二氢钾缓冲液(体积比25∶75)的pH值为5.0、4.5、4.0、3.5、3.0和2.5。

结果显示,pH值越低色谱峰的峰形越好,柱效越高,因此选择pH值3.0作为最佳色谱条件(表2)。

2.4线性关系
将配置的标准溶液分别进样2、4、6、8、10、15、20 μL至HPLC在1.2所述条件下进行检测,每个重复测定3次,测定的峰面积取平均值。

以峰面积为横坐标x、质量浓度为纵坐标y,绘制标准曲线得到线性方程,如表3所示。

2.5酶转化液中各组成的色谱分析
工程菌Rosetta pET-HyuH是南京工业大学生化重点实验室构建保存的具有D-海因酶活性,能水解5-吲哚甲基海因转化为D-氨甲酰-N-色氨酸的工程菌。

通过
考察不同反应时间(0、0.5、1.0、2.0 h)酶反应液的色谱图可以发现,随着反应时间的延长,底物5-吲哚甲基海因(保留时间为8.28 min)不断被消耗,产物D-氨甲酰-N-色氨酸(保留时间为6.43 min)逐渐积累,且减少量与增加量基本同步(图2)。

对照为未进行50 ℃酶解反应就立即收集菌体的上清液。

结果表明,在2.22 min和2.49 min(出峰时间)处的峰可能是菌体自身代谢的其他产物,含量甚微。

另取1 mL菌液,加入最终浓度为1 g/L的底物(5-吲哚甲基海因)反应4 h,D-氨甲酰-N-色氨酸的转化率可达98.7%。

由于构建含有D-氨甲酰水解酶(DCase)的工程菌的工作还在进行中,希望能很快将本方法运用到工程菌DCase活性的测定中。

2.6回收率和精密度
取4份反应时间均为2.0 h的酶促反应液200 μL,其中1份作为本底,依次在余下的3份酶反应液中加入低、中、高3种不同浓度的标准溶液各200 μL,过膜后按1.2所述检测方法和条件进行测定,每个样品连续进样6次,按测定峰面积的平均值进行计算,测定结果如表4所示。

从表4可以看出,该方法的回收率和精密度良好。

3结论与讨论
采用Merck Purospher STAR RP-C18e(4.6 mm×250.0 mm,5 μm),以乙腈-20 mmoL/L磷酸二氢钾(体积比25∶75,pH值3.0)为流动相,有效地解决了海因酶法生产D-色氨酸的生产体系中底物、中间产物和产物含量的测定,D-色氨酸,D-氨甲酰-N-色氨酸和5-吲哚甲基海因的测量线性范围分别是0.10~1.00、0.20~2.00、0.20~2.00 mg/mL;D-氨甲酰-N-色氨酸和5-吲哚甲基海因的加标回收率分别为99.3%~102.0%及98.0%~99.3%;精密度分别为0.51%~0.87%和0.43%~0.94%。

该方法操作简便,准确度高,为该生产过程中工艺条件的优化和过程监控提供了一种十分有效的方法。

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