低温产甲烷复合菌系的选育及干、湿发酵的比较

低温产甲烷复合菌系的选育及干、湿发酵的比较
摘要：将3个低温厌氧环境样品Y、S、Z进行干、湿发酵低温驯化，选育适宜低温干、湿发酵的稳定、高效产甲烷复合菌系。

样品Y、S、Z在（19±0.5）℃条件下进行干发酵低温驯化，分别在第6代、第7代、第6代产气基本稳定，第8代65 d总产气量分别为42.60、40.50、41.70 L，总固体（TS）产气率分别为266.25、253.13、260.63 L/kg。

复合菌系Y最适接种量为25%，甲烷含量最高为72.9%，COD去除率最高为77.17%；样品Y、S、Z在相同条件下进行湿法酸化发酵低温驯化，分别在第7代、第7代、第8代产气基本稳定，第9代55 d总产气量分别为35.48、34.52、33.78 L，TS产气率分别为221.75、215.75、211.13 L/kg；3组复合菌系稳定世代在干发酵和湿法酸化发酵中均使得沼气发酵启动期比第1代提前5 d以上。

经差异显著性分析，相同发酵方法下不同复合菌系间总产气量差异达到显著水平。

关键词：低温驯化；沼气发酵类型；总产气量；甲烷纯度；COD
温度是限制低温沼气发展的重要因素，低于20 ℃时沼气发酵效率会显著下降，我国北方年平均气温为1.3 ℃，若在低温季节进行沼气发酵需人为加热保温，增加了运行成本，而使得沼气发酵难以在北方推广。

此外，湿发酵沼液量大，处置不当易造成二次污染，若干发酵替代湿发酵不仅利用秸秆解决生物质能转化问题，而且减少其焚烧所带来的空气污染[1]。

试验采用不同生境来源的样品，利用微生物对环境适应性及温度对其的选择作用在干、湿发酵中进行低温驯化，比较干、湿发酵优越性并且选育稳定、高效、适宜低温干、湿发酵的产甲烷复合菌系，为低温沼气工程提供试验参数及菌种资源。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源样品选择厌氧污泥Y、水稻田污泥S、沼气发酵液Z。

1.1.2 底物及试剂牛粪酸化液：将9 kg干牛粪与9L水在塑料桶里混合均匀，自然酸化待pH降至6时，用KHCO3溶液将其pH调至7，装料时将TS调至8%。

未酸化底物：将9 kg干牛粪与3 kg粉碎的秸秆充分混合[2]，加水搅拌均匀，装料时将TS调至20%作为干发酵底物[3]；将TS调至8%作为未酸化物料湿发酵底物。

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1.2.2 湿法驯化将样品Y、S、Z分别接入盛有1L牛粪酸化液和1L未酸化物料TS 为8%的3 L玻璃瓶中，3次重复。

密封后放入（19±0.5）℃生化培养箱中培养；定期测定产气量及CH4含量，将产气量、CH4含量高的培养物继代培养至性能稳定为止。

1.2.3 产气量与气体成分测定采用排水法测定产气量；采用GC-14C2010气
相色谱进行气体成分分析。

1.2.4 统计分析方法试验数据采用SPSS Statistics-V19.0数据分析软件进行统计分析，采用LSR最小显著极差法进行多重比较。

1.2.5 干发酵不同接种量干发酵中将复合菌系Y按接种量20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%分别接入试验组中，设置3次重复。

1.2.6 干发酵COD去除率取干发酵原料测初始COD，接种25%低温产甲烷复合菌系Y后密封培养，每隔6 d测甲烷浓度并取其发酵物测COD，计算COD 去除率，设置3次重复。

2 结果与分析
2.1 干发酵总产气量动态变化
由图1可知，3个样品的总产气量随着传代次数增加而增加。

样品Y从第2代起每代总产气量都高于S和Z，第6代时样品Y和Z产气开始稳定，第7代时样品S产气开始稳定。

样品Y第8代65 d总产气量为42.60 L，较第1代提高47.4%，产气启动期较第1代提前7 d，产气量优于样品S和Z。

2.2 湿法酸化发酵总产气量动态变化
如图2所示，湿法酸化发酵复合菌系世代间总产气量变化规律同干法。

样品Y从第4代起总产气量都高于S和Z，平均分别提高5.68%和5.53%，样品Y和S在第7代产气开始稳定，样品Z在第8代时产气开始稳定。

样品Y第9代55 d 总产气量为35.48 L，较第1代提高36.58%，产气启动期较第1代提前6 d，产气量优于样品S和Z。

2.3 不同发酵方法对复合菌系Y产气量的影响
2.3.1 不同发酵方法对复合菌系Y总产气量的影响如图3所示，样品Y干发酵与湿法酸化发酵每代总产气量都高于湿法未酸化发酵，第8代干发酵与湿法酸化发酵总产气量较湿法未酸化发酵提高50.84%和38.33%。

干发酵前两代总产气量低于湿法酸化发酵，经驯化后第6代产气高于湿法酸化发酵。

经荧光显微镜及电镜扫描观测到菌系中以八叠球菌为主[4]。

由于干发酵物料中纤维素含量高，发酵性菌群分泌的纤维素酶将大量纤维素分解成单糖，单糖被进一步分解成乙酸、氢气和二氧化碳等[5]，产甲烷菌直接利用前体物质转化成甲烷，由于底物浓度大，前体物质的生成得到保障，因此产气量高。

而牛粪自然酸化过程中，发酵菌群已将大分子有机质分解成能溶于水的小分子化合物，接种复合菌系后发酵菌群与产氢产乙酸菌直接将小分子化合物转化为乙酸、氢气、二氧化碳等产甲烷前体物质，使得产甲烷前体物质充分供给，因此，产气量高于湿法未酸化发酵。

2.3.2 干发酵复合菌系Y对日产气量的影响干发酵低温产甲烷复合菌系Y第8代日产气量变化动态如图4所示。

接种复合菌系Y后第2天开始产气，产气持
续上升至第5天时有所下降，此阶段气体主要为CO2。

第5天后产气持续上升至17 d时达到峰值1 200 mL/d，之后缓慢下降趋于稳定，稳定期日产气量稳定在800～900 mL一段时间后产气一直下降。

65 d产气过程中CH4纯度在50%以上的时间达到55 d。

2.3.3 湿法酸化发酵复合菌系Y对日产气量的影响湿法酸化发酵复合菌系Y第9代日产气量变化动态如图5所示。

接种复合菌系Y第2天开始产气并持续上升至第5天时略有下降，此阶段气体成分以CO2为主，此后产气持续上升至18 d时达到峰值1 100 mL/d，随后产气下降至21 d趋于稳定，稳定期持续18 d日产气量维持在650～900 mL，之后产气一直下降。

产气55 d中CH4纯度在50%以上时间达到44 d。

2.4 不同样品产气特性分析
目前中温湿发酵8%的TS产气率为218.0～262.0 L/kg[6]，中温干发酵20%的TS产气率为218.5～250.0 L/kg[7，8]。

由表1可知，3个样品干发酵与湿法酸化发酵总产气量、甲烷含量及TS产气率虽然有差异，但所选育的复合菌系Y、S、Z在干发酵和湿法酸化发酵中已达到或接近中温产气率水平，干发酵TS产气率已超过湿法酸化发酵产气率水平。

统计分析表明，不同来源的样品经低温驯化稳定后其产气性能有差异，相同发酵方法下低温产甲烷复合菌系间总产气量差异达显著水平。

因此，低温产甲烷复合菌系驯化前的样品采集要有针对性与选择性。

2.5 干发酵不同接种量对复合菌系Y日均产气量的影响
由图6可知，随着接种量的增加，日均产气量缓慢递增，接种量为25%时，日均产气量达到最高，接种量大于25%时日均产气量呈缓慢下降趋势。

这是因为启动阶段甲烷菌数量少且活性差，为使运行中产生的大量有机酸转化为甲烷，避免有机酸积累，必须保证一定数量的甲烷菌，所以增加接种量日均产气量增加[9]，但接种量过大时，导致发酵中总固体含量提高，发酵过程中容易产生过量的有机酸，引起发酵物料的酸化，pH下降，从而影响日均产气量。

因此，干发酵中复合菌系Y最适接种量为25%。

2.6 干发酵复合菌系Y COD与日产气量的关系
如图7所示，随着日产气量的增加COD呈下降趋势，日产气量增加幅度大时COD下降幅度也增大，日产气量达峰值时COD下降幅度最大，发酵过程中COD的变化符合产气变化规律。

产气高峰期大量有机质中碳素被用于生成甲烷，因此COD下降幅度较大。

干发酵低温复合菌系Y第7代COD去除率达77.17%[10-12]。

3 结论
1）通过低温驯化从不同厌氧样品中选育出的复合菌系Y、S、Z干发酵分别在第6代、第7代、第6代产气稳定，第8代65d总产气量分别为42.60、40.50、
41.70 L，TS产气率分别为266.25、253.13、260.63 L/kg；湿法酸化发酵分别在第7代、第7代、第8代产气稳定，第9代55 d总产气量分别为35.48、34.52、33.78 L，TS产气率分别为221.75、215.75、211.13 L/kg；不同复合菌系稳定世代在干发酵和湿法酸化发酵中均使沼气发酵启动期提前5 d以上，所选育的低温复合菌系Y、S、Z在干发酵和湿法酸化发酵中已达到或接近中温产气水平。

2）复合菌系Y在干发酵与湿法酸化发酵中产气效果均良好，干发酵中复合菌系Y接种量为25%时产气效果最好，甲烷含量最高时为72.9%，COD去除率最高为77.17%。

形态学观察菌系中多以八叠球菌为主。

3）干发酵与湿法酸化发酵产气效果好于湿法未酸化发酵；干发酵TS产气率高于湿法酸化发酵水平。

经差异显著性分析，相同发酵方法下不同复合菌系间总产气量差异达到显著水平。

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