克林霉素磷酸酯及其有关物质USP测定方法的优化研究
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LC-solution 工作站）；1200 型高效液相色谱仪（美国 安捷伦公司）（包括：四元泵、自动进样器、VWD 检 测器、chemstation 工作站）；BP211D 型电子天平（十 万分之一，Sartorius 公司）。
供试品：克林霉素磷酸酯（批号：SCPT1105001， SCPT1105002， SCPT1105003， SCPT1105004， SCPT1105005，苏州第四制药厂有限公司）。对照品： 克林霉素磷酸酯、盐酸林可霉素、盐酸克林霉素、克林 霉素 B 磷酸酯（苏州第四制药厂有限公司自制作为 工作标准品）；林可霉素磷酸酯（美国某公司提供）；乙 腈、甲醇（HPLC 级，美国 TEDIA 公司生产）；磷酸、氨 水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产）。
【作者简介】：*夏振华(1965－)，男，高级工程 师 【联系电话】：13906136642
E-mail：xiazhenhua8@
· 116 ·
ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2012 June; 9(2) E-mail: kgryx@ Tel: 86-512-65180291 Fax: 86-512-66607096
XIA Zhen-hua*，JING Feng-ming，CHEN Bai-ke
Suzhou No.4 Pharmaceutical factory Co.，Ltd，Suzhou Jiangsu 215008，China
ABSTRACT Objective:To study and to compare the determination of clindamycin phosphate and its related substances through the optimization of the USP 33 edition of HPLC method. Methods: A HPLC method was used with C8(250 mm× 4.6 mn, 5 μ m) column and a mobile phase was gradient elution using the mixture of pH 5.6 buffer solution acetonitrile and methanol, the column temperature was at 40 ℃, flow rate was 1.2 mL/min and the detection wavelength was 214 nm. Results: The good separation of clidamycin phosphate and its relevant materials was obtained. The linear response range of clindamycin phosphate was between 1.41 and 2.09 mg/mL and the average recovery was 98.26%; the linear response range of lincomycin was between 0.71 and 32.95 μg/mL and average recovery was 91.73%; the linear response range of lincomycin phosphate wasbetween 0.92 and 33.12 μg/mL and average recovery was 92.88%; the linear response range of clindamycin B phosphate was between 0.80 and 64.72 μg/mL and average recovery was 98.04%; the linear response range of clindamycin was between 1.11 and 32.91 μg/mL and average recovery was 97.50%. Conclusion: The separation results show that the optimization method possess a stronger enantioselectivity than USP 33 edition method, the baseline is more stable and the amount of clidamycin phosphate and its related substances can be accurately detected. KEY WORDS clindamycin phosphate; related substances; HPLC; optimization
克林霉素磷酸酯及其有关物质 USP 测定方法的优化研究
夏振华*，井凤鸣，陈百科
苏州第四制药厂有限公司，江苏 苏州 215008
【摘 要】 目的：通过优化的 USP 33 版中 HPLC 方法研究与比较克林霉素磷酸酯及其有关物质测定结果。方法：采用
HPLC 法，C8 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温 40 ℃；流动相采用 pH=5.6 的缓冲液-乙腈-甲醇的混合溶液梯度洗脱，流
[Anti Infect Pharm，2012，9(2):115~119]
克林霉素磷酸酯（clindamycin phosphate）又称 克林霉素-2-磷酸酯[1]，是以盐酸林可霉素为起始物料 的半合成抗菌药物，具有良好的吸收性，被广泛应用 于临床。其合成过程产生的主要杂质有林可霉素磷 酸酯、克林霉素 B 磷酸酯、克林霉素、7-表克林霉素 磷酸酯、克林霉素-3-磷酸酯以及其他未知杂质。由
0.92~33.12 μg/mL，平均回收率为 92.88%；克林霉素 B 磷酸酯 0.80~64.72 μg/mL，平均回收率为 98.04%；克林霉素 1.11~
32.91 μg/mL，平均回收率为 97.50%。结论：优化后的方法比 USP 33 版中的方法分离能力更强，基线较为平稳，更能准确测
2 方法与结果
2.1 对照品溶液及供试品溶液的制备 2.1.1 对照品溶液 精密称取克林霉素磷酸酯对 照品 22 mg，倾入 10 mL 容量瓶中，按“2.1.4”流动 相的配制项下的稀释剂稀释至刻度，超声处理 5 min 使其完全溶解，得对照品溶液(以下称 A 液）。 2.1.2 供试品溶液-1 精密称取克林霉素磷酸酯供 试品 22 mg，倾入 10 mL 容量瓶中，按“2.1.4”流动 相的配制项下的稀释剂稀释至刻度，超声处理 5 min 使其完全溶解，得供试品溶液-1(以下称 B 液）。 2.1.3 供试品溶液-2 精密称取克林霉素磷酸酯供 试品 22 mg，倾入 10 mL 容量瓶中，加入一定量的 盐酸林可霉素、林可霉素磷酸酯、克林霉素 B 以及 盐酸克林霉素对照品，按“2.1.4”流动相的配制项下 的稀释剂稀释至刻度，超声处理 5 min 使其完全溶 解，得供试品溶液-（2 以下称 C 液）。 2.1.4 流动相的配制 ⑴缓冲液：取 14 mL 磷酸加 入 4 000 mL 纯化水中，加氢氧化铵溶液，调节溶液 至 pH=5.6；⑵有机溶液：取乙腈和甲醇按体积（9∶1） 混合均匀；⑶稀释剂：取上述缓冲液和有机溶液按 体积（8∶2）混合均匀；⑷溶液-A：取缓冲液和有机溶 液按体积（9.2∶0.8）混合均匀；⑸溶液-B：取缓冲液和
分离度较差，出峰重合，影响检测结果的选择度和准 确度。笔者参照 USP 33 版中有关克林霉素磷酸酯 及其有关物质 HPLC 测定方法，通过调整流动相的 pH 值，按照 ICH[3]要求进行了方法学考察，测定了主 要有关物质的响应因子，并将其测定结果与 USP 33
版法作了比较。
1 仪器与试药
LC-20A 型高效液相色谱仪（ 日本岛津公司） （ 包 括 ：四元泵、自动进样器、SPD-20A 型检测器、
G B
21.268
10.743
D
A
C
EF
H
I
15.540 16.481
19.054 19.7ຫໍສະໝຸດ 429.64322.268
7.693
5
10
15
20
25 30
时间（t/min)
注：A.林可霉素磷酸酯；B.林可霉素；C.未知杂质；D.克林霉素 B 磷酸 酯；E.未知杂质；F.未知杂质；G.克林霉素磷酸酯；H. 未知杂质；I.克林 霉素。
5.0
备注
平衡 线性梯度 线性梯度
平衡
2.2 色谱条件 采 用 HPLC 法 ，C8 色 谱 柱 5 μm，4.6 mm ×
250 mm）；柱温 40 ℃；紫外检测波长 214 nm；流速 1.2 mL/min；进样量 20 μL。在以上色谱条件下，克 林霉素磷酸酯理论塔板数为 89 042，与其最邻近峰 的分离度为 3.5。 2.3 方法学考察 2.3.1 专属性 取对照品按“2.2”色谱条件项下的 方法进行分离检测，并用对照品（盐酸林可霉素、林 可霉素磷酸酯、克林霉素 B 磷酸酯、盐酸克林霉素） 分别对各杂质峰进行定位。结果表明该色谱条件 测定专属性良好，克林霉素磷酸酯主峰与其最邻近 的杂质峰完全分离（分离度 R＞2）。克林霉素磷酸 酯及其有关物质的 HPLC 色谱图情况，见图 1。
速 1.2 mL/min，检测波长 214 nm。结果：克林霉素磷酸酯主峰与其最邻近的有关物质，以及各有关物质得到很好的分离；主
成分克林霉素磷酸酯在浓度 1.41~2.09 mg/mL 范围内与峰面积响应值呈良好线性关系，平均回收率为 98.26%；主要有关物
质在下述浓度范围与峰面积响应值线性关系良好；林可霉素 0.71~32.95 μg/mL，平均回收率为 91.73%；林可霉素磷酸酯
于林可霉素常常出现在克林霉素磷酸酯原料药中， 故将其作为有关物质一并讨论，而其中 7-表克林霉 素磷酸酯和克林霉素-3-磷酸酯正处在分离、纯化阶 段，故暂将其视作未知杂质。现行美国药典（USP） 33 版采用 HPLC 法测定克林霉素磷酸酯及有关物 质的量[2]，但克林霉素磷酸酯主峰与其邻近的杂质峰
有机溶液按体积（5.2∶4.8）混合均匀。克林霉素磷酸 酯及有关物质的测定梯度洗脱情况，见表 1。
表 1 梯度洗脱程序
时间 (t/min)
0 0~40 40~41 41~46
溶液-A (%)
95.0 95.0→5.0 5.0→95.0
95.0
溶液-B (%)
5.0 5.0→95.0 95.0→5.0
定克林霉素磷酸酯及有关物质的量。
【关键词】 克林霉素磷酸酯；有关物质；HPLC 法；优化
【中图分类号】 R 927.2
【文献标志码】 A 【文章编号】 1672-7878(2012)02-115-005
Studies on Optimization for USP Determination Method of Clindamycin Phosphate and Its Related Substances
图 1 克林霉素磷酸酯及有关物质的 HPLC 色谱图
2.3.2 溶液稳定性试验 取“2.1.3”供试品溶液-2 项下 C 液，分别于 0，4，8，12，24，32，44，48 h 时测 定，按“2.2”色谱条件项下的方法进样，记录色谱图， 计算克林霉素磷酸酯及有关物质的质量。每次应取 “2.1.1”对照品溶液项下 A 液同法测定，用于校正不 同时间测定仪器导致的误差。其 8 次测试结果的 RSD 分别为：克林霉素磷酸酯为 0.36%，林可霉素 为 0.51%，林可磷酸酯 RSD 为 1.20%，克林霉素 B 磷酸酯 RSD 为 0.40%，克林霉素 RSD 为 5.50%。表
抗 感 染 药 学 Anti Infect Pharm 2012 June; 9(2) 夏振华，等.克林霉素磷酸酯及其有关物质 USP 测定方法优化的研究
· 115 ·
DOI：10.3969/j.issn.1672-7878.2012.02-009
网络出版时间：2012-04-20 08:31
网络出版地址：/kcms/detail/32.1726.R.20120420.0831.009.html
供试品：克林霉素磷酸酯（批号：SCPT1105001， SCPT1105002， SCPT1105003， SCPT1105004， SCPT1105005，苏州第四制药厂有限公司）。对照品： 克林霉素磷酸酯、盐酸林可霉素、盐酸克林霉素、克林 霉素 B 磷酸酯（苏州第四制药厂有限公司自制作为 工作标准品）；林可霉素磷酸酯（美国某公司提供）；乙 腈、甲醇（HPLC 级，美国 TEDIA 公司生产）；磷酸、氨 水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产）。
【作者简介】：*夏振华(1965－)，男，高级工程 师 【联系电话】：13906136642
E-mail：xiazhenhua8@
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ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2012 June; 9(2) E-mail: kgryx@ Tel: 86-512-65180291 Fax: 86-512-66607096
XIA Zhen-hua*，JING Feng-ming，CHEN Bai-ke
Suzhou No.4 Pharmaceutical factory Co.，Ltd，Suzhou Jiangsu 215008，China
ABSTRACT Objective:To study and to compare the determination of clindamycin phosphate and its related substances through the optimization of the USP 33 edition of HPLC method. Methods: A HPLC method was used with C8(250 mm× 4.6 mn, 5 μ m) column and a mobile phase was gradient elution using the mixture of pH 5.6 buffer solution acetonitrile and methanol, the column temperature was at 40 ℃, flow rate was 1.2 mL/min and the detection wavelength was 214 nm. Results: The good separation of clidamycin phosphate and its relevant materials was obtained. The linear response range of clindamycin phosphate was between 1.41 and 2.09 mg/mL and the average recovery was 98.26%; the linear response range of lincomycin was between 0.71 and 32.95 μg/mL and average recovery was 91.73%; the linear response range of lincomycin phosphate wasbetween 0.92 and 33.12 μg/mL and average recovery was 92.88%; the linear response range of clindamycin B phosphate was between 0.80 and 64.72 μg/mL and average recovery was 98.04%; the linear response range of clindamycin was between 1.11 and 32.91 μg/mL and average recovery was 97.50%. Conclusion: The separation results show that the optimization method possess a stronger enantioselectivity than USP 33 edition method, the baseline is more stable and the amount of clidamycin phosphate and its related substances can be accurately detected. KEY WORDS clindamycin phosphate; related substances; HPLC; optimization
克林霉素磷酸酯及其有关物质 USP 测定方法的优化研究
夏振华*，井凤鸣，陈百科
苏州第四制药厂有限公司，江苏 苏州 215008
【摘 要】 目的：通过优化的 USP 33 版中 HPLC 方法研究与比较克林霉素磷酸酯及其有关物质测定结果。方法：采用
HPLC 法，C8 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温 40 ℃；流动相采用 pH=5.6 的缓冲液-乙腈-甲醇的混合溶液梯度洗脱，流
[Anti Infect Pharm，2012，9(2):115~119]
克林霉素磷酸酯（clindamycin phosphate）又称 克林霉素-2-磷酸酯[1]，是以盐酸林可霉素为起始物料 的半合成抗菌药物，具有良好的吸收性，被广泛应用 于临床。其合成过程产生的主要杂质有林可霉素磷 酸酯、克林霉素 B 磷酸酯、克林霉素、7-表克林霉素 磷酸酯、克林霉素-3-磷酸酯以及其他未知杂质。由
0.92~33.12 μg/mL，平均回收率为 92.88%；克林霉素 B 磷酸酯 0.80~64.72 μg/mL，平均回收率为 98.04%；克林霉素 1.11~
32.91 μg/mL，平均回收率为 97.50%。结论：优化后的方法比 USP 33 版中的方法分离能力更强，基线较为平稳，更能准确测
2 方法与结果
2.1 对照品溶液及供试品溶液的制备 2.1.1 对照品溶液 精密称取克林霉素磷酸酯对 照品 22 mg，倾入 10 mL 容量瓶中，按“2.1.4”流动 相的配制项下的稀释剂稀释至刻度，超声处理 5 min 使其完全溶解，得对照品溶液(以下称 A 液）。 2.1.2 供试品溶液-1 精密称取克林霉素磷酸酯供 试品 22 mg，倾入 10 mL 容量瓶中，按“2.1.4”流动 相的配制项下的稀释剂稀释至刻度，超声处理 5 min 使其完全溶解，得供试品溶液-1(以下称 B 液）。 2.1.3 供试品溶液-2 精密称取克林霉素磷酸酯供 试品 22 mg，倾入 10 mL 容量瓶中，加入一定量的 盐酸林可霉素、林可霉素磷酸酯、克林霉素 B 以及 盐酸克林霉素对照品，按“2.1.4”流动相的配制项下 的稀释剂稀释至刻度，超声处理 5 min 使其完全溶 解，得供试品溶液-（2 以下称 C 液）。 2.1.4 流动相的配制 ⑴缓冲液：取 14 mL 磷酸加 入 4 000 mL 纯化水中，加氢氧化铵溶液，调节溶液 至 pH=5.6；⑵有机溶液：取乙腈和甲醇按体积（9∶1） 混合均匀；⑶稀释剂：取上述缓冲液和有机溶液按 体积（8∶2）混合均匀；⑷溶液-A：取缓冲液和有机溶 液按体积（9.2∶0.8）混合均匀；⑸溶液-B：取缓冲液和
分离度较差，出峰重合，影响检测结果的选择度和准 确度。笔者参照 USP 33 版中有关克林霉素磷酸酯 及其有关物质 HPLC 测定方法，通过调整流动相的 pH 值，按照 ICH[3]要求进行了方法学考察，测定了主 要有关物质的响应因子，并将其测定结果与 USP 33
版法作了比较。
1 仪器与试药
LC-20A 型高效液相色谱仪（ 日本岛津公司） （ 包 括 ：四元泵、自动进样器、SPD-20A 型检测器、
G B
21.268
10.743
D
A
C
EF
H
I
15.540 16.481
19.054 19.7ຫໍສະໝຸດ 429.64322.268
7.693
5
10
15
20
25 30
时间（t/min)
注：A.林可霉素磷酸酯；B.林可霉素；C.未知杂质；D.克林霉素 B 磷酸 酯；E.未知杂质；F.未知杂质；G.克林霉素磷酸酯；H. 未知杂质；I.克林 霉素。
5.0
备注
平衡 线性梯度 线性梯度
平衡
2.2 色谱条件 采 用 HPLC 法 ，C8 色 谱 柱 5 μm，4.6 mm ×
250 mm）；柱温 40 ℃；紫外检测波长 214 nm；流速 1.2 mL/min；进样量 20 μL。在以上色谱条件下，克 林霉素磷酸酯理论塔板数为 89 042，与其最邻近峰 的分离度为 3.5。 2.3 方法学考察 2.3.1 专属性 取对照品按“2.2”色谱条件项下的 方法进行分离检测，并用对照品（盐酸林可霉素、林 可霉素磷酸酯、克林霉素 B 磷酸酯、盐酸克林霉素） 分别对各杂质峰进行定位。结果表明该色谱条件 测定专属性良好，克林霉素磷酸酯主峰与其最邻近 的杂质峰完全分离（分离度 R＞2）。克林霉素磷酸 酯及其有关物质的 HPLC 色谱图情况，见图 1。
速 1.2 mL/min，检测波长 214 nm。结果：克林霉素磷酸酯主峰与其最邻近的有关物质，以及各有关物质得到很好的分离；主
成分克林霉素磷酸酯在浓度 1.41~2.09 mg/mL 范围内与峰面积响应值呈良好线性关系，平均回收率为 98.26%；主要有关物
质在下述浓度范围与峰面积响应值线性关系良好；林可霉素 0.71~32.95 μg/mL，平均回收率为 91.73%；林可霉素磷酸酯
于林可霉素常常出现在克林霉素磷酸酯原料药中， 故将其作为有关物质一并讨论，而其中 7-表克林霉 素磷酸酯和克林霉素-3-磷酸酯正处在分离、纯化阶 段，故暂将其视作未知杂质。现行美国药典（USP） 33 版采用 HPLC 法测定克林霉素磷酸酯及有关物 质的量[2]，但克林霉素磷酸酯主峰与其邻近的杂质峰
有机溶液按体积（5.2∶4.8）混合均匀。克林霉素磷酸 酯及有关物质的测定梯度洗脱情况，见表 1。
表 1 梯度洗脱程序
时间 (t/min)
0 0~40 40~41 41~46
溶液-A (%)
95.0 95.0→5.0 5.0→95.0
95.0
溶液-B (%)
5.0 5.0→95.0 95.0→5.0
定克林霉素磷酸酯及有关物质的量。
【关键词】 克林霉素磷酸酯；有关物质；HPLC 法；优化
【中图分类号】 R 927.2
【文献标志码】 A 【文章编号】 1672-7878(2012)02-115-005
Studies on Optimization for USP Determination Method of Clindamycin Phosphate and Its Related Substances
图 1 克林霉素磷酸酯及有关物质的 HPLC 色谱图
2.3.2 溶液稳定性试验 取“2.1.3”供试品溶液-2 项下 C 液，分别于 0，4，8，12，24，32，44，48 h 时测 定，按“2.2”色谱条件项下的方法进样，记录色谱图， 计算克林霉素磷酸酯及有关物质的质量。每次应取 “2.1.1”对照品溶液项下 A 液同法测定，用于校正不 同时间测定仪器导致的误差。其 8 次测试结果的 RSD 分别为：克林霉素磷酸酯为 0.36%，林可霉素 为 0.51%，林可磷酸酯 RSD 为 1.20%，克林霉素 B 磷酸酯 RSD 为 0.40%，克林霉素 RSD 为 5.50%。表
抗 感 染 药 学 Anti Infect Pharm 2012 June; 9(2) 夏振华，等.克林霉素磷酸酯及其有关物质 USP 测定方法优化的研究
· 115 ·
DOI：10.3969/j.issn.1672-7878.2012.02-009
网络出版时间：2012-04-20 08:31
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