超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF_省略_OPG_RANKL表达比值的影响_李晓彦

超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF_省略_OPG_RANKL表达比值的影响_李晓彦
超声对大鼠牙骨质修复过程中T GF-β1 表达和O PG/RANKL
表达比值的影响*
李晓彦霍俊滨霍娜刘永召王晓玲徐娟
目录
超声对大鼠牙骨质修复过程中T GF-β1 表达和O PG/RANKL表达比值的影响* (11)
【摘要】
目的：研究超声在大鼠牙骨质修复过程中对转化
生长因子- β1(TGF- β1)表达和骨保护蛋白、核因
子-KB 受体活化因子配体(OPG/ RANKL)表达比值
的影响。

方法：选择32 只健康雄性Wistar 大鼠
建立正畸性牙根吸收动物模型，随机分为4 组，
每组8 只，分别为空白对照组，单纯加力组，自然
修复组，超声修复组，其中用频率1. 5MHz，强度
100MW/ cm2 的治疗超声对超声修复组的实验牙在2
周的修复期进行每天15min 治疗超声照射。

2 周
治疗结束后，取上颌第一磨牙及其牙周组织，制作以
上颌第一磨牙为中心的，近远中方向的组织切片，行
TGF- β1，OPG，RANKL，免疫组化染色，光镜观察
并作免疫组化光密度分析，对实验结果进行单因
素方差分析。

结果：
超声修复组TGF- β1 的光密度值
(0. 36228±0. 02833)，明显高于自然修复
组(0. 24576 ±0. 03183)，差异有统计学意义。

超声修复组OPG/ RANKL 光密度值比值(1. 1126 ±0.
096)，也明显高于自然修复组(0. 7835±0. 067)差
异有统计学意义。

结论：超声通过上调TGF- β1
表达，改变OPG/ RANKL 的比值，促进牙骨质的修
复重建。

关键词：超声；牙根吸收；牙骨质；TGF- β1；
OPG/ RANKL
[中国图书分类号] R782. 1 [文献标识码] A
[文章编号] 1009-
3761(2013)01- 0011- 05
Effects of ultrasound on the expressions of TGF-β1 and OPG / RANKL
ratio during cementum reconstruction pro－cess in rat
LI Xiao-yan,HUO Jun-bin,HUO Na,LIU
Yong-zhao,WANG Xiao-ling,XU Juan.
(Departmen t of Orthodontic s,General Hospita l of
Chines e PLA,Beijin g100853,China)
12
13
14
1;
牙根吸收是正畸治疗的常见并发症，发生率在3%- 100%[1]。

牙根吸收的机理与骨吸收基本类似，由与破骨细胞形态和生物学功能相似的破牙骨质细胞承担主要破牙骨质功能。

与牙根吸收的这一破坏性过程相伴随的是牙周膜组织的修复活动，当牙根吸收的进程停止，破牙骨质细胞失去活性并从牙根表面分离出去，成牙骨质细胞开始进行修复活动，类牙骨质修复基质沉积，钙化，新生牙骨质形成
[2]，新生牙骨质在吸收陷窝中沉积，牙周膜重建，
修复吸收所造成的缺损[3]。

在这种吸收 - 修复转换的过程中，多种调控因
子共同参与成牙骨质细胞祖细胞的募集，表达，分
化，和牙骨质的修复。

其中，骨保护蛋白(os-teopr oteger in OPG)、核因子- KB 受体活化因子配体 (r eceptor activator nuclear factor kappaB ligand RANKL). 转化生长因子-
β(transf orming growth factor- β TGF- β)均参与这一过程并发挥其作用[4]。

超声是一种辐射频率高于
人类听觉范围的声波辐射，以高频声学压缩波传导至人
体组织，能在生理和生物化学方面对细胞产生较大影
响，并能作为一种生物活性治疗工具[5]。

在体外细胞实验中，超声可影响多种细胞因子的表达；在骨科和齿科
15
领域，超声已被报道用于骨不连的位置增强骨形成[6]。

很多研究也显示超声能够抑制牙根吸收，并促进牙骨质的修复，本研究对其机制进行深一步探讨。

1. 材料和方法
1. 1 实验动物及分组选择 8 周龄的健康雄性Wistar 大鼠 32 只(解放军总医院实验动物中心提供)，将其按体重编号，并随机分为 4 组，每组 8只，分别为空白对照组，单纯加力组，自然修复组，超声修复组。

1. 2 动物模型的建立
在健康雄性wistar 大鼠口内置入加力装置，在切牙与第一磨牙间置入镍钛拉簧，施以
100g 力(1g= 9. 8×10- 3N)，
加力2 周，为牙齿加力
期，建立正畸性牙根吸收模
型；后去除加力装置，观察
2 周，为牙根修复期，用以
观察牙根吸收陷窝的修复情
况。

动物模型建模标准参照
参考文献[7]。

实验以大鼠右
侧上颌第一磨牙为实验牙，0.
7ml/ kg 速眠新注射液(军事
医学科学院军事
兽医研究所)腹腔注射麻醉
后仰卧固定，左右中切牙
远中轴角龈缘磨沟，由0.
012 英寸(1 英寸=2. 54mm)
镍钛拉簧(圣玛特公司)加载
于两颗中切牙与第一磨牙之
间，同一实验者用测力计
(长沙天天齿科有限公司)
测力两次，确保初始力值
100g，0. 20mm 结扎丝结
扎，同时牙釉质粘结树脂增
强固位。

每天检查弹簧，以
16
防脱落。

空白对照组不接受任何处理，其余三组的大鼠均在口内置入加力装置，加力两周后，单纯加力组的大鼠断颈处死，取组织标本备用；自然修复组和超声修复组的大鼠在加力两周后去除加力装置，在加力侧第一和第二磨牙之间填充自凝树脂材料，以保持第一磨牙不再发生移动；超声修复组大鼠剃去实验侧面颊部毛发，在 2 周的修复期每天用频率1. 5MHz, 强度 100MW/ cm2 的低频超声治疗仪(Smith & Nephew Medical Inc 型号 EXOGEN2000+)紧贴实验侧皮肤(有效作用面积4cm2)，照射15min。

1. 3 组织标本制备加
力2 周后将动物断颈处死取材，进行组织学分析。

将标本固定于10％中性
缓冲甲醛溶液中48h，经15%EDTA (乙二胺四乙酸)溶液脱钙45d，75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、99. 9%乙醇逐级脱水，二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制作以上颌第一磨牙为中心的近远中方向的4μm厚
的组织切片。

1. 4 HE 染色，TGF- β1，OPG，RANKL 免疫组化染色本实验采用 TGF- β1，OPG，RA NKL 多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，SP 免疫组化试剂盒和DAB 显色盒(北京中山生物公司)，按说明书步骤
进行免疫组化染色，以PBS(pH 7. 4 的磷酸盐缓冲
17
液)代替一抗做阴性对照，选取大鼠远中第三牙
根根尖近中区，运用Imagepr o- Plus 6. 0 软件测量各组单个光镜视野(×400)下阳性产物的平均光密度值。

1. 5
统计学分析运用SPSS
13. 0 统计软件对数据
行单因素方差分析，采用组间多重比较SNK - q 检验法。

2. 结果组织学染色结
果显示：牙根吸收主
要发生在牙
根的受力侧。

与自然修
复组相比，超声修复组
可见增厚的修复性牙骨质(见图1 )。

18
空白对照组和自然修复
组OPG 表达为弱阳性，单
纯加力组和超声修复组OPG 表达阳性(见图3)。

空白
对照组和自然修复组RANKL 表达阳性，单纯
加力组 RANKL 表达强阳性, 超声修复组RAN- KL 表达
弱阳性(见图4)。

A 空白对照组: 牙骨质完整
连续，无吸收陷窝B 单纯加力
组：部分牙
骨质丧失，
可见大量深
而不规则的
吸收陷窝
A 空白对
照组：
OPG表
达弱阳
19
B 单纯加力组：B OPG表达阳性
C 自然修复组: 牙骨质不连续，局部可见少量新生牙骨质形
成D 超声修复组：可见吸收陷窝中大量形成新生牙骨质，如箭头所示
图1 各组大鼠根尖近中区HE 染色(× 100)
免疫组织化学染色结果
显示：TGF- β1，OPG，
RANKL 阳性表达定位于细胞质，呈现棕黄色；牙周膜，牙骨质以及骨吸收陷窝内的破骨细胞均为阳性表达部位。

PBS 代替一抗做阴性对照，未见阳C 自然修
复组：
OPG表
达弱阳
性
D 超声修
复
组：
OPG
表达
阳性
性表达，空白对照组和单纯加力组 TGF- β1 表达阳性，自然修复组TGF- β1 表达弱阳性，超声修复组 TGF- β1 表达强阳性(见图2)。

图3 各组大鼠根尖近中区OPG 免疫组化染色(×400)
A 空白对
照组：
RANKL
表达阳
性B 单纯加
力组：
RANKL
表达强
阳性
A 空白对照组：TGF- β1表达阳性
B 单纯加力组：
C 自然修复组：TGF- β1
表达弱阳性
22
)
牙根吸收与修复这一过程中，TGF- β1 公认是调节O PG/ RANKL 比值的上游信号，分别对破骨细胞和成骨细胞的分化形成起到重要的作用[11- 12]。

超声能够增加生长因子和其他信号分子的合成，骨源性分化和细胞外基质的生成[13]，这可能是
分组OPG
平
均
光
密
度
值0.11529±RANK
L 平
均
光密
度值
0.15
078
±
OPG/
RANK
L
比值
0.76
46±
由于机械应力和 / 或作
用于细胞膜，黏着斑，细
胞支架结构的液体微流动
冲击力，触发细胞内信号
空白对照组
单纯加力组自然修复组超声修复组0.
01
04
9
0.1
323
1±
0.
00
65
5
0.1
158
3±
0.0
118
3
0.1
370
4±
0.
01
24
7
0.
21
30
8
±
0.
01
02
1
0.14819±
0.01104
0.12497±
0.024 0.6214±
0.054 a 0.7835±
0.067 b
1.1126±a b c 转
换
并
诱
导
基
因
转
录
引
起
的。

以
往
的
体
外
细
胞
实
验
研
究
表
明
：
超
声
作
用
于
成
牙
骨
质
细
胞
，
不
仅
能
增
强
O
P
G
的
表
达
，
还
可
影
响
其
碱
性
磷
酸
酶
的
m
R
N
A
表
达
并
增
强
细
胞
内
钙
含
量
[14]，增强再矿化的进
程；超声作用于大鼠颅顶
组织培养，能上调 TGF-
β的表
与OPG 的比值，当这一平衡倾向于OPG 时，表现为活性破骨细胞数目减少，当平衡倾向于RANKL 时，活本研究通过观
察大鼠牙根牙
周膜中调控因
子的表达，来研究超声对牙
骨质修复所起
到的作用及其
可能存在的机制。

实验结果
显示，与大鼠
牙根吸收模型自然修复两周
相比较，使用
频率为 1. 5MHz,强度100MW/
cm2 的超声作用于大鼠牙根吸
收模型 2 周后，大鼠牙根
表面的牙骨质
修复明显增
强。

免疫组化染色结果显
示：单纯加力
组TGF- β1 的表达与空白对照组相比，并未有明显改变。

而单纯加力组的OPG/ RANKL 比值与空白对照组相比，比值明显降低，差异有统计学意义。

单纯加力组的O PG 与 RANKL 的光密度值要明显高于空白对照组，RANKL 的增长幅度更是显著高于OPG。

说明在大鼠牙根吸收过程中，OPG 和RANKL 在正畸力的作用下，表达发
生改变，比值
降低，使牙周
改建朝向吸收的方向进行，但TGF- β1 表达无明显变化，由此可推测，在大鼠牙根吸收过程中，TGF- β1 作为调节OPG ／RANKL 比值的上游信号，并未在 OPG/ RANKL 比值的变化中发生作用；与自然修
复组相比较，
超声修复组的TGF- β1 的表达明显增强，
OPG/ RANKL 比值也明
PG 表达的增强，以及RANKL 表达的降低。

4. 结论
超声通过影响牙周膜中TGF- β1 表达，间接作用于OPG／RA NKL／RANK 通路，上调OPG ／RANKL 比值，抑制破骨细胞的形成，刺激成牙骨质骨细胞的增殖和活化，促进了牙骨质修复。

参考文献
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