外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞的乙醛脱氢酶1 mRNA及蛋白表达

外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞的乙醛脱氢酶1
mRNA及蛋白表达
韩明利;吴诚义;莫志强;彭琼乐;王艺梦;屈洪波
【摘要】目的本研究旨在探讨外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞对乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)mRNA及蛋白表达的影响。

方法用不同浓度(1、5 ng/mL)的TGF-β1诱导体外培养的MCF-7细胞48 h后，RT-PCR检测ALDH1 mRNA的表达变化，Western b1ot检测ALDH1蛋白的表达变化。

结果 TGF-β1(1、5 ng/mL)诱导的MCF-7细胞的ALDH1 mRNA及蛋白表达均高于未诱导的MCF-7亲本细胞，差异有统计学意义(P均＜0.001)；高浓度(5 ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞的ALDH1 mRNA及蛋白表达均高于低浓度(1 ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞，差异有统计学意义(P均＜0.001)。

结论外源性TGF-β1可诱导人乳腺癌MCF-7细胞上调ALDH1 mRNA及蛋白的表达，可能诱导ALDH1+乳腺癌肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的转化，并有一定的浓度依赖性。

%Objective To investigate the effects of exogenous TGF-β1 on the regulation of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDHl) expression in human breast cancer MCF-7 cells. Methods MCF-7 cells were induced with TGF-)31 at different concentrations (1,5 ng/mL) for 48 hours. ALDHl expression in these cells was then analyzed at mRNA and protein levels by RT-PCR and Western blot assay, respectively. Results ALDHl mRNA and protein expressions were up-regulated in TGF-β induced (1, 5 ng/mL) MCF-7 cells compared with normal MCF-7 cells, respectively (All
P<0.001). They were also up-regulated in MCF-7 cells induced with TGF-β1 at higher concentration (5 ng/mL) compared with MCF-7 cells induced
with TGF-β1 at lower concentration (1 ng/mL), respectively (All P <0.001). Conclusions Exogenous TGF-β1 up-regulats expressions of ALDHl mRNA and protein in human breast cancer MCF-7 cells in the manner of concentration-dependence, and TGF-β1 may mediates the convention of cancer stem cells (CSC) to breast cancer cells.
【期刊名称】《复旦学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(038)004
【总页数】3页(P340-342)
【关键词】TGF-β1；乙醛脱氢酶1；乳腺癌；上皮-间质转化；肿瘤干细胞
【作者】韩明利;吴诚义;莫志强;彭琼乐;王艺梦;屈洪波
【作者单位】重庆医科大学附属第一医院内分泌外科,重庆400016;重庆医科大学附属第一医院内分泌外科,重庆400016;重庆医科大学附属第一医院内分泌外科,重庆400016;重庆医科大学基础医学院细胞生物学及遗传学教研室,重庆400016;重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心,重庆400016;重庆医科大学附属第一医院,重庆400016;重庆医科大学附属第一医院内分泌外科,重庆400016【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
研究证实,人TGF-β1是乳腺癌细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的主要诱导剂[1-3],EMT可以诱导乳腺癌细胞转化为具有
CD44+CD24-/low表型的乳腺癌干细胞(cancer stem cell,CSC)[4-6]。

CD44+CD24-/low表型与乙醛脱氢酶 1+(aldehyde dehydrogenase
1+,ALDH1+)表型都被认为是乳腺癌CSC标志物[7-8]。

目前,关于TGF-β1诱导EMT与ALDH1表达之间的相关性研究尚未见报道。

我们设想TGF-β1在诱导乳
腺癌细胞发生EMT使乳腺癌细胞转化为乳腺癌CSC的同时,还可能影响乳腺癌CSC标志物ALDH1的表达。

本研究旨在探讨外源性TGF-β1在诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生EMT的同时对ALDH1 mRNA及蛋白表达的影响。

材料和方法
实验材料人乳腺癌MCF-7细胞系(中国科学院上海细胞库);TGF-β1(美国R&D公司);高糖-DMEM培养基和FBS(美国HyClone公司);多克隆兔抗人ALDH1抗体(英国Abcame公司);HR标记羊抗兔IgG多抗和Westren blot试剂盒(杭州四季
青生物工程材料有限公司);总RNA试剂Trizol(美国Gibco BRL公司);RT-PCR试
剂盒(上海贝博生物试剂公司)。

实验方法
细胞培养及处理37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中,在含 10%FBS、100
U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和5 U/L胰岛素的高糖-DMEM培养基中培养MCF-7细胞,用质量分数为0.25%的胰酶消化传代。

细胞培养至融合70%～80%后,用无血清培养基饥饿过夜,然后加入不同浓度(1、5 ng/mL)的 TGF-β1处理48 h,按实验要求分组。

RT-PCR检测 ALDH1 mRNA的表达用Trizol一步法分别提取经不同浓度(1、5 ng/mL)TGF-β1诱导的和未诱导的 MCF-7细胞总RNA,具体操作按照试剂盒说明进行。

采用Primer 5软件设计PCR引物,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR 上游引物:5′-GGCAGCCATTTCTTCTCA-3′,PCR 下游引物:5′-TTGTCCAAGTCGGCATCA-3′,PCR扩增片段长度为168 bp。

PCR反应条件:96℃预变性5 min,96℃变性50 s,55℃退火50 s,72℃延伸60 s,共32个循环;扩增产物
经2%琼脂糖凝胶电泳分析并拍照,通过检测紫外线吸光度分别测得目的基因ALDH1与内参β-actin的吸光度值,以ALDH1与β-actin的吸光度值比值作为ALDH1 mRNA表达的相对水平。

Western blot检测ALDH1蛋白的表达不同浓度(1、5 ng/mL)TGF-β1诱导MCF-7细胞 48 h后,将培养瓶中贴壁细胞用预冷的PBS洗涤后转移到10 mL离心管中,4℃下1 000 r/min离心5 min,弃上清,将收集到的细胞转移到 EP管中,加入RIPA蛋白裂解液裂解,反应30 min,4℃下12 000 r/min离心30 min,取上清液置于-20℃冰箱保存备用。

配胶,蛋白上样量50μg/孔,80 V电压0.5 h使蛋白积聚,120 V电压1.5 h使蛋白分离,转膜,Western blot封闭液封闭过夜。

次日,用多克隆兔抗人ALDH1抗体(一抗,1∶500)分别与膜接触,室温孵育2 h;用Western blot洗涤液在脱色摇床上洗膜10 min×3次;将HR标记羊抗兔 IgG多抗(二抗)与膜接触,室温孵育2 h;用Western blot洗涤液洗膜10 min×3次;加入ECL化学发光显示剂在室温下反应1 min后,上机显像拍照,扫描图像灰度值,计算目的蛋白ALDH1与内参β-actin的灰度比值作为ALDH1蛋白表达的相对水平。

统计学分析应用SPSS 13.0统计分析软件,计量数据以±s表示,两组间均数的比较用t检验进行统计分析。

P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
TGF-β1对ALDH1 mRNA表达的影响检测紫外线吸光度后计算目的基因ALDH1与内参β-actin的吸光度比值作为ALDH1 mRNA表达的相对水平,每个样本重复3次,取平均值。

结果显示:未经诱导的MCF-7细胞和 1、5 ng/mL TGF-β1诱导的MCF-7细胞中ALDH1 mRNA的表达分别为0.248±0.026、0.952±0.046、1.772±0.060,各组间差异均有统计学意义(P值均＜0.001)。

即TGF-β1诱导的MCF-7细胞中ALDH1 mRNA均较未诱导的MCF-7亲本细胞高表达;高浓度TGF-β1(5 ng/mL)诱导的MCF-7细胞中ALDH1 mRNA较低浓度TGF-β1(1
ng/mL)诱导的MCF-7细胞高表达(图1A)。

TGF-β1对ALDH1蛋白表达的影响 Western blot图像灰度扫描后计算目的蛋白ALDH1与内参β-actin的灰度比值,每个样本重复3次,取平均值。

结果显示:1、5 ng/mL TGF-β1诱导的MCF-7细胞和未经诱导的MCF-7细胞中ALDH1蛋白表达分别为0.039±0.004、0.155±0.012、0.289 ±0.012,各组间差异均有统计学意义(P值均＜0.001)。

即TGF-β1诱导的 MCF-7细胞中ALDH1蛋白均较未诱导的MCF-7亲本细胞高表达;高浓度TGF-β1(5 ng/mL)诱导的MCF-7细胞中ALDH1蛋白较低浓度TGF-β1(1 ng/mL)诱导的MCF-7细胞高表达(图1B)。

图1 不同浓度 TGF-β1诱导的MCF-7细胞中ALDH1 mRNA和蛋白的表达Fig 1 Expressions of ALDH1 mRNA and protein in TGF-β1-induced MCF-7 cells assessed by RT-PCRA:ALDH1 mRNA expression detected by RT-
PCR;B:ALDH1 protein expression detected by Western ne 1:0
ng/mL;Lane 2:1 ng/mL;Lane 3:5 ng/mL;M:Marker.
讨论
研究显示,TGF-β1信号转导通路通过EMT参与乳腺癌的侵袭和转移[1-3];乳腺癌CSC被认为是乳腺癌侵袭和转移的罪魁祸首[9-10]。

本研究通过改变人乳腺癌MCF-7细胞培养环境中TGF-β1的浓度,证实TGF-β1信号转导通路能调控乳腺癌CSC标志物ALDH1 mRNA及蛋白的表达。

TGF-β1作为 TGF-β家族的重要成员之一,在乳腺癌浸润和转移的过程中作为EMT 的主要诱导剂[1-3]。

Mani等[4]发现经历EMT的乳腺癌细胞具备了乳腺癌CSC 的特性,如成瘤、自我更新、抗凋亡及形成乳腺球的能力等,同时发现
CD44+CD24-/low表型的细胞明显增多,由此认为EMT可以诱导乳腺癌细胞转化为具有CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌CSC,此观点已被越来越多的研究所证实[5-6]。

我们认为,EMT可以诱导乳腺癌细胞转化为乳腺癌CSC,但并不局限于
CD44+CD24-/low表型,也可能转化为ALDH1+表型乳腺癌CSC。

ALDH1是组织中正常干细胞及CSC生长、分化的必需物质,可以作为正常干细胞
及CSC的标志物在多种组织中起重要作用。

研究证实,ALDH1+与CD44+CD24-
/low都是乳腺癌 CSC标志物,并且ALDH1的高表达与乳腺癌的发生、发展、预后和转移密切相关[7-8]。

我们推测,外源性TGF-β1可以诱导乳腺癌细胞经历EMT,
进而可能转化为ALDH1+乳腺癌CSC,从而引起ALDH1 mRNA及蛋白的表达变化。

我们的研究结果证实了这一推测,人乳腺癌MCF-7细胞在经 TGF-β1诱导
后,ALDH1 mRNA及蛋白的表达均发生了显著性变化:TGF-β1诱导的MCF-7细胞中ALDH1 mRNA和蛋白表达均较未诱导的MCF-7亲本细胞有所上调;高浓度TGF-β1诱导的MCF-7细胞中ALDH1 mRNA和蛋白表达较低浓度TGF-β1诱导的MCF-7细胞有所上调。

本实验证明,外源性 TGF-β1诱导乳腺癌MCF-7细胞后上调了ALDH1 mRNA及
蛋白的表达,并呈一定的浓度依赖性。

我们认为TGF-β1、EMT和乳腺癌CSC三者之间存在相互关联和影响。

在TGF-β1信号转导通路介导乳腺癌细胞经历EMT的机制中包括上调乳腺癌CSC标志物ALDH1的表达。

TGF-β1信号转导通路可能也通过调控ALDH1来介导乳腺癌细胞的侵袭和转移,为乳腺癌细胞的侵袭和转移提
供了新的机制,并再次肯定了TGF-β1在肿瘤微环境中的重要地位及其对乳腺癌患
者预后的影响。

我们推测,TGF-β1可能具有促静止期乳腺癌CSC活化的效应,但需要进一步的研究证实。

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