PBMC提取

PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。

其中淋巴细胞占很大一部分。

分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。

Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml 仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。

红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。

吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。

注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。

分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。

否则将分层混乱。

步骤：
配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
c.将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
d.取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。

然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。

离心完毕将得到如图所示分层；
PBMC所在细胞层为白色。

此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml 离心管中。

e.加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
f.加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
g.细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。

取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。

再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。

第二天将细胞转入液氮中长期保存。

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