抗体制备及效价测定讲义

抗体制备及效价测定讲义
实验一、兔抗人IgG制备
一、实验材料
1．实验动物：健康雄性家兔1只；
2．抗原：纯化人IgG lmg；
3．实验试剂：完全福氏佐剂（CFA），不完全弗氏佐剂（IFA），0.01M PBS（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000 mL），普鲁卡因溶液，肾上腺素，硫柳汞，叠氮钠。

4．实验用具：2.5mL、5mL注射器，10mL无菌小烧杯，塑料静脉插管，5mL无菌冻存管，250mL 无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管。

二、操作步骤
1．抗原制备：
将纯化的人IgG用0.01M PBS（pH7.2）或生理盐水稀释成lmg/mL，加入等体积无菌CFA或IFA 至5mL无菌冻存管中，置于超声波破碎仪上，粉碎头浸入液面下0.5-0.8 cm，离瓶底距离0.5 cm左右，以免打碎玻璃瓶，抗原置冰上，每次乳化10-15秒，间隔1分钟左右，反复乳化3-4次即。

将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。

2．家兔免疫：
（1）家兔捉拿方法：一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来，放在实验台上，如图1：
图1 家兔的捉拿方法
（2）初次免疫：在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处选择6-10处免疫接种点，采用肌内、皮下或皮内注射，每点注射上述乳化人IgG抗原0.2mL。

（3）二次免疫：第一次免疫后间隔2周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。

（4）三次免疫：第二次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。

（5）终末免疫：第三次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。

3．试血：
末次免疫7天后经兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强l-2次后，再行检测。

4．颈动脉放血：
（1）将免疫家兔仰面固定于固定架上，头部放低，暴露颈部。

（2）沿颈部中线用2％普鲁卡因溶液局部麻醉，15分钟后剪开颈中部皮肤10cm长。

沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌。

（3）分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉，将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端。

（4）腹腔内注射肾上腺素1mg，以升高血压，加快心率，避免因放血后血压降低造成凝集而影响取血量。

（5）先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。

用小的尖头眼科剪刀在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管，再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出。

（6）轻轻松开止血钳，血液很快射入玻璃瓶皿，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。

5．血清分离：
（1）将血液置室温中凝固约1小时，然后置4℃过夜，使血块收缩。

（2）用无菌移液管吸取上层血清，转移至50 mL无菌尖底离心管中。

（3）将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一50 mL无菌尖底离心管，在4℃下2500g离心30分钟，取上清液即血清部分与前面的血清混合。

℃离心30分钟，弃沉淀收集血清。

（4）将混合血清41500g
6．抗血清保存
（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入0.0l％硫柳汞或0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。

（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存5年抗体效价不会有明显下降。

抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。

实验二、兔抗苏云金芽孢杆菌抗体制备
一、实验材料
1．实验动物：健康雄性家兔1只；
2．抗原：苏云金芽孢杆菌；
3．实验试剂：LB固体培养基，0.01M PBS，甲醛溶液，普鲁卡因溶液，肾上腺素，硫柳汞，叠氮钠。

4．实验用具：2.5mL、5mL注射器，10mL小烧杯，塑料静脉插管，5mL无菌冻存管，250mL无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管。

二、操作步骤
1．抗原制备：
斜面生长的抗原性完整的苏云金芽孢杆菌菌体，进行细菌计数，用含0.3％甲醛的0.01M PBS （pH7.2）制成浓悬液，37℃孵育24小时，无菌实验合格后倾入50 mL无菌尖底离心管，在4℃下10000g离心10分钟，取沉淀用0.01M PBS稀释至1×1010个细菌/mL，置4℃备用。

2．免疫前试血：
兔耳缘静脉采血1mL，分离血清，与苏云金芽孢杆菌进行凝集实验，检测家兔有无天然凝集素存在，选取与苏云金芽孢杆菌凝集实验结果阴性的家兔进行以下免疫。

3．家兔免疫：
取浓度1×1010个细菌/mL的苏云金芽孢杆菌菌体悬液2mL，用耳静脉注射免疫途径免疫家兔，每周注射2次，连续注射4周。

4．试血：
末次注射7天后兔耳缘静脉采血1-2mL，分离血清，与苏云金芽孢杆菌进行凝集实验，如果抗血清效价>1:2000即可放血。

如效价达不到要求，继续加大剂量静脉加强1-3次后，常可使效价明显增高。

颈动脉放血、血清分离、保存等实验操作与实验一相同。

实验三、鼠抗人IgG制备
一、实验材料
1．实验动物：健康8-10周龄雌性昆明鼠4只；
2．抗原：纯化人IgG lmg；
3．实验试剂：完全福氏佐剂（CFA），不完全弗氏佐剂（IFA），0.01M PBS（pH7.2），硫柳汞；4．实验用具：1mL、2.5mL注射器，小烧杯，抗凝毛细管，5mL无菌冻存管，1.5mL无菌尖底离心管，支管烧瓶，真空泵。

二、操作步骤
1．抗原制备：
将纯化的人IgG用0.01M PBS（pH7.2）或生理盐水稀释成lmg/mL，加入等体积无菌CFA或IFA
至5mL无菌冻存管中，置于超声波破碎仪上，粉碎头浸入液面下0.5-0.8 cm，离瓶底距离0.5 cm左右，以免打碎玻璃瓶，抗原置冰浴上，每次乳化10-15秒，间隔1分钟左右，反复乳化3-4次即可完全乳化。

2．小鼠免疫：
（1）小鼠捉拿方法：从笼盒内将小鼠尾部捉住并提起，放在笼盖上，轻轻向后拉鼠尾，在小鼠向前挣脱时，用左手拇指和食指抓住两耳和颈部皮肤，无名指、小指和手掌心夹住背部皮肤和尾部，并调整好动物在手中的姿势（如图1）。

图1 小鼠的捉拿方法
（2）初次免疫：分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射乳化人IgG抗原0.2mL，腹腔注射乳化人IgG抗原0.2mL。

（3）二次免疫：第一次免疫后间隔2周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射乳化人IgG抗原0.2mL，腹腔注射乳化人IgG抗原0.2mL。

（4）三次免疫：第二次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射乳化人IgG抗原0.2mL，腹腔注射乳化人IgG抗原0.2mL。

（5）终末免疫：第三次免疫后间隔1周再以lmg／mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射乳化人IgG抗原0.2mL，腹腔注射乳化人IgG抗原0.2mL。

3．试血：
末次注射7天后小量采血约0.2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强l-2次后，常可使效价增高。

鼠小量采血可采用以下三种方法：
（1）毛细管法：右手提鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，取用肝素或其它抗凝剂处理过的医用毛细采血管，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将毛细管一端紧压鼠眼球，手指捻动毛细管刺破鼠眼球，鼠血可顺毛细管流入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。

（2）拔眼球法：右手提鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，用镊子拔去一侧鼠眼球，将鼠血滴入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。

注意不要让小鼠流血过多，以免死亡。

（3）断尾取血：固定小鼠并保证尾巴可以自由活动，剪去尾尖（距末端约1cm），迅速置于与真空泵连接的分支烧瓶中，开启真空泵，血自尾尖流出，让血液滴入锥形瓶中的1.5mL离心管内。

取血0.2mL，用棉球压迫止血。

4．拔眼球放血：
右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min，用镊子拔去一侧鼠眼球，将鼠血
滴入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。

5．血清分离：
（1）将血液置室温中放置，使血液凝固，血块收缩。

（2）待鼠血凝固后用无菌移液管吸取上层血清，转移至1.5mL无菌离心管中。

（3）在4℃下2500g离心30分钟，取上清液即可。

6．抗血清保存
（1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入0.0l％硫柳汞或0.1％叠氮钠，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。

（2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20-40℃，一般保存5年抗体效价不会有明显下降。

抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。

抗血清保存等实验操作与实验一相同。

实验四、鼠抗苏云金芽孢杆菌抗体制备
一、实验材料
1．实验动物：健康8-10周龄雌性昆明鼠4只；
2．抗原：苏云金芽孢杆菌；
3．实验试剂：完全福氏佐剂，0.01M PBS（pH7.2），硫柳汞；
4．实验用具：1-2mL注射器，小烧杯，抗凝毛细管，5mL无菌冻存管，1.5mL无菌尖底离心管。

二、操作步骤
1．抗原制备：
斜面生长的抗原性完整的苏云金芽孢杆菌菌体，用0.3％甲醛0.01M PBS（pH7.2）制成浓悬液，37℃孵育24小时，无菌实验合格后用盐水稀释至1×1010个细菌/mL，置4℃备用。

2．免疫前试血：
鼠眼球毛细管采血法采集鼠血分离血清，与苏云金芽孢杆菌进行凝集实验，检测小鼠有无天然凝集素存在，选取与苏云金芽孢杆菌凝集实验结果阴性的小鼠进行以下免疫。

3．小鼠免疫：
取浓度1×1010个细菌/mL的苏云金芽孢杆菌菌体悬液0.4mL，腹腔注射免疫途径免疫小鼠，每周注射1次，连续注射4周。

4．试血：
末次注射7天后鼠眼球毛细管采血法采集鼠血分离血清，与苏云金芽孢杆菌进行凝集实验，如果抗血清效价>1:2000即可放血。

如效价达不到要求，继续加大剂量静脉加强1-3次后，常可使效价明显增高。

小鼠拔眼球放血、血清分离、保存等实验操作与实验三相同。

实验五、凝集试验测定兔、鼠抗血清效价
一、原理
凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质(如细菌、螺旋体、红细胞、聚苯乙烯胶乳等)，与相应抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的凝集团块现象。

早在1896年，Widal就利用伤寒患者的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象，有效地诊断伤寒病。

至1900年，Landsteriner在特异性血凝现象的基础上发现了人类血型，并于1930年获得了诺贝尔奖。

在颗粒性抗原与相应抗体所产生的凝集反应中，参与反应的抗原称凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。

凝集实验灵敏度高，方法简便，迄今已成为通用的免疫学实验技术，广泛应用于临床检验。

细菌或其他凝集原都带有相同的电荷（负电荷），在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。

抗原与抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在着相互对应的化学基团，因而发生特异性结合，成为抗原抗体复合物。

由于抗原与抗体结合，降低了抗原分子间的静电排斥力，抗原表面的亲水基团减少，由亲水状态变为疏水状态，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒。

出现了肉眼可见的凝集反应。

一般细菌凝集均为菌体凝集（O凝集），抗原凝集呈颗粒状。

有鞭毛的细菌如果在制备抗原时鞭毛未被破坏（鞭毛抗原在56℃时即被破坏），则反应出现鞭毛凝集（H凝集），鞭毛凝集时呈絮状凝块。

凝集反应的发生分两个阶段：①抗原抗体的特异结合；②出现可见的颗粒凝集。

抗原与抗体相遇，很快就发生特异性结合，至于是否会出现可见反应，则受一定条件的影响。

二、实验材料
1．抗原：1×1010个细菌/mL苏云金芽孢杆菌悬液；
2．抗血清：鼠抗苏云金芽孢杆菌血清，兔抗苏云金芽孢杆菌血清；
3．实验试剂：0.01M PBS（pH7.2）；
4．实验用具：96孔V型血凝板，1000µL微量可调加样器及吸头，1.5mL无菌尖底离心管，离心管架。

三、操作步骤
1．稀释抗血清：
取1.5mL无菌尖底离心管8支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入生理盐水0.5ml，吸取1:10稀释的鼠抗或兔抗苏云金芽孢杆菌血清0.5ml加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出0.5ml加入第2管中，经充分混匀后吸出0.5ml加入第3管中，如此依次2×稀释至第7管，混匀后吸出0.5ml弃去。

此时1-7管所含免疫血清的稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280，第8管不加免疫血清做为阴性对照。

2．加抗血清：
在血凝板孔中加入上述1~8管的稀释抗血清和对照各250µL。

3．加菌悬液：
在上述各孔中各加1×1010个细菌/mL苏云金芽孢杆菌悬液250µL。

4．凝集反应：
平稳涡式混合血凝板中液体，静置于37℃下，1小时后观察结果并写出实验记录。

5．结果观察
（1）观察前切勿摇动试管，以免凝集分散；
（2）首先应观察对照管，该管因无相对应的免疫血清故不应有凝集现象，苏云金芽孢杆菌菌体应全部沉于试管底部呈规则圆盘状，如出现凝集现象则说明实验操作有误或抗原本身有自凝现象，试验结果不能成立。

（3）对照管无凝集现象，试验结果成立再观察1~7试验管，并以++++、+++、++、+，分别表示凝集强度，不凝集者记以“-”。

A． ++++：完全凝集，呈厚膜状铺于管底，边缘呈锯齿状。

B．+++：呈薄层贴于管底，边缘不齐。

C．++：中央呈较小园盘状沉淀，边缘凝集呈颗粒状。

D．+：呈较大的园盘状沉淀，边缘有少量凝集颗粒。

E．-：无凝集，细胞沉于管底园盘状。

图1 凝集反应强度示意图
（4）以血清最高稀释度仍能出现“++”凝集现象者，作为该免疫血清的效价（滴度）。

例如，在实验中第5管（1:640）呈“++”凝集，第6管（1:1280）呈“+”凝集或“-”，对照管为“-”，则该血清的效价为1:640。

实验六、琼脂双扩散试验
一、原理
在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物，发生免疫沉淀反应。

当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线。

利用这种反应检测抗原抗体反应的实验技术叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。

免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。

沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。

当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。

二、实验材料
1．抗原：用0.01M PBS（pH7.2）或生理盐水稀释成lmg/mL人IgG；
2．抗血清：鼠抗人IgG血清，兔抗人IgG血清；
3．实验试剂：0.01M PBS（pH7.2），1%琼脂糖；
4．实验用具：11cm培养皿，200µL微量可调加样器及吸头，1.5mL无菌尖底离心管，打孔器。

三、操作步骤
1．1%琼脂糖配制：
称取琼脂糖1克，加入0.01M PBS（pH7.2）100mL，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。

2．倒平板：
取干净11cm培养皿3个平放于实验台（台面要水平），将融化的1%琼脂糖趁热倒培养皿中（约加15mL），使琼脂糖厚度达3mm，在室温下放置使琼脂糖冷却凝固。

3．打孔：
将琼脂糖平板放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器（内径3-5毫米）在琼脂上照样板打孔，打出两组呈梅花状排列的小孔。

用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。

图1 双向琼脂扩散实验打孔示意图图2 双向琼脂扩散实验结果示意图4．抗原稀释：
取1.5mL无菌尖底离心管6支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入生理盐水50µL，吸取1:10稀释的lmg/mL人IgG 50µL加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出50µL加入第2管中，经充分混匀后吸出50µL加入第3管中，如此依次2×稀释至第6管，混匀后吸出50µL弃去。

此时1-6管所含人IgG的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。

5．抗血清稀释：
取1.5mL无菌尖底离心管8支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入生理盐水50µL，吸取鼠抗或兔抗人IgG血清50µL加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出50µL加入第2管中，经充分混匀后吸出50µL加入第3管中，如此依次2×稀释至第6管，混匀后吸出50µL弃去。

此时1-6管所含免疫血清的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。

6．加样：
在每组呈梅花状排列的小孔的中央孔中加一滴稀释抗原约30µL的免疫血清，周围孔加不同稀释
度抗血清。

加样时将每孔加满即可，注意不要使溢出孔外。

7．孵育
盖上培养皿盖放37℃温箱中过夜。

8．结果观察
将培养皿从塑料盒中取出，在散射光的背景下（培养皿后方约15cm处用手或深色物挡住）观察，或在凝胶成像系统上用白光光源观察抗体孔与适当稀释的抗原孔之间的白色沉淀线，有沉淀线为阳性，否则阴性。

实验七、ELISA测定兔、鼠抗血清效价
近几十年来免疫学分析方法迅猛发展，特别是在使用抗原和抗体标记分析技术后，检测敏感性和特异性比原来许多经典的免疫学分析方法得到极大提高。

上世纪50年代建立免疫荧光技术（IFA），60年代放射免疫分析技术（RIA）出现，在70年代初期又建立了酶标记抗原或抗体的分析技术。

由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十、几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由V AN Weemen和Schuars，Enagvall和Perlmarn等相继分别报道后，现已引起广泛重视。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

图1 间接ELISA示意图
二、实验材料
1．抗原：用0.01M PBS（pH7.2）稀释成lmg/mL人IgG；
2．抗血清：鼠抗人IgG血清，兔抗人IgG血清；
3．实验试剂：0.01M PBS（pH7.2），0.01M碳酸盐缓冲液（1.59 g NaCO3，2.93 g NaHCO3，加ddH2O 至1000 mL），0.01M PBST（pH7.2，含0.05％ Tween-20），1%BSA，HRP-羊抗鼠IgG，HRP-羊抗兔IgG，TMB/H2O2底物液，2M H2SO4；
4．实验用具：96孔酶标板，200µL微量可调加样器及吸头，5mL无菌试管，洗板机，酶标仪。

三、操作步骤
1．抗原稀释：
取5mL无菌试管8支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入0.01M碳酸缓冲液（pH9.6）2.34mL，吸取260µL lmg/mL人IgG加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出1.3mL加入第2管中，经充分混匀后吸出1.3mL加入第3管中，如此依次2×稀释至第8管，混匀后吸出1.3mL弃去。

此时1-8管抗原的稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1024、1:2048。

2．抗血清稀释：
取5mL无菌试管12支排列于离心管架上并做好标记，在每管各加入0.01M PBS（pH7.2），0.9mL，吸取1:50稀释的鼠抗或兔抗人IgG血清0.9mL加入第1管中并充分混匀；自第1管中吸出0.9mL加入第2管中，经充分混匀后吸出0.9mL加入第3管中，如此依次2×稀释至第12管，混匀后吸出0.9mL 弃去。

此时1-12管所含免疫血清的稀释度为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:51200、1:102400、1:204800、1:409600。

3．包被酶标板：
在96孔酶标板A行各孔加入1:20稀释的人IgG 100µL，B-H行各孔依次加入其余各稀释度的人IgG 100µL，于37℃温浴1小时后将酶标板平放在湿盒中4℃过夜。

4．封闭
取出96孔酶标板，设置程序用洗板机吸净或甩干各孔中包被液，将96孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干，每孔各加入用0.01M PBST（pH7.2）稀释的1%BSA 100µL，37℃孵育1小时。

5．洗板
取出96孔酶标板，设置程序用0.01M PBST（pH7.2）洗板机洗酶标板各孔3次，每次浸泡1min。

或人工洗板即每孔加满0.01M PBST（pH7.2），浸泡3-5分钟，甩干后再重复洗涤操作2次，将96孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干或拍干。

6．加抗血清：
在96孔酶标板1列各孔加入1:100稀释的人IgG100µL，2-12列各孔依次加入其余各稀释度的人IgG100µL，12列最后4孔留作对照，H12不加任何血清留作空白对照、G12和F12孔加入未免疫动物血清作阴性对照，E12孔加入免疫动物未稀释血清做阳性对照，将酶标板平放在湿盒中37℃孵育1小时。

7．洗板
操作同步骤5。

8．加酶标二抗
在96孔酶标板各孔加入用0.01M PBST（pH7.2）稀释至使用浓度的HRP-羊抗鼠IgG或HRP-
羊抗兔IgG100µL，，将酶标板平放在湿盒中37℃孵育1小时。

9．洗板
操作同步骤5。

10．加底物
在96孔酶标板各孔加入TMB底物A液、B液各50µL，，将酶标板避光，37℃孵育10min。

11．加终止液
在96孔酶标板各孔加入50µL2M H2SO4，终止反应。

12．酶标仪读数
在630nm波长下以空白孔H12调零，设定阴性对照孔OD读数的2.1倍为阈值，OD值大于阈值的判断为阳性，小于阈值的判断为阴性。

实验六、蛋白印迹（western blot）实验
印记技术是20世纪分子生物学领域的三大发现之一，它与内切酶的发现和PCR扩增技术一到给人类生物工程带来了革命性的进展。

印迹法的原理是将生物大分子物质（如核酸或蛋白质）通过不同的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，可与相应的探针反应，即显出谱带。

自从1975年建立印迹法以来，目前比较成熟的有四种印记方法已被广为采用，其中三种分别称为Southern、Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋白质。

1982年，Reinhart将其建立的双向蛋白质印记称为Eastern印迹法，而Western印迹法（Western blot, WBT）又称为免疫印迹（immunoblot, IBT）。

免疫印迹可以分为斑点印迹和电泳转移印记。

前者是将样品用抽滤法或是直接吸附于固相载体上，而后者是将样品先经过电泳再转移到固相载体表面。

它的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫结合起来，其主要的操作分为三个过程：1）将抗原物质经SDS-PAGE凝胶电泳分离；2）将分离的组分从PAGE凝胶上转移到固相基质上，如硝酸纤维素膜等，此过程称为印记，以利于随后的检测反应的进行；3）对转移后的组分分别进行免疫检测，与抗血清一起孵育，使以及抗体与待检测的抗原决定簇结合，再与经荧光素、酶或核素标记的第二抗体反应，显示出蛋白组分区带，并可对其进行定量。

一、实验材料
1. 待检抗原：人IgG
2. SDS-PAGE相关试剂
（1）电泳缓冲液：5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：75.5g Tris碱，470g甘氨酸（电泳级，pH8.3），250mL 10% SDS（电泳级），加ddH2O溶解定容至5000mL；
（2）Tris-HCl缓冲液：
1.5mol/L Tris-Cl (pH8.8): Tris碱 181.7g溶于ddH2O中，用HCl调pH值至8.8，定容至1000mL。

1.0mol/L Tris-Cl (pH6.8)：Tris碱121.1g溶于ddH2O中，用HCl调pH值至6.8，定容至1000mL。

（3）10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于10mL ddH2O中，4℃保存。

（4）2×SDS凝胶加样缓冲液：10mL 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8），3.1g 二硫苏糖醇（DTT），4g SDS，0.2g溴酚蓝，20mL甘油，定容至100mL；
（5）30%聚丙烯酰胺母液：将145g丙烯酰胺和5g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于300mL ddH2O中，加热至37℃溶解，定容至500mL，4℃避光保存备用；
（6）12%SDS聚丙烯酰胺（分离胶，20mL）：6.6mL ddH2O，8mL 30%丙烯酰胺溶液，5mL 1.5mol/L Tris（pH8.8），0.2mL 10%SDS，0.2mL 10%过硫酸铵，0.008mL TEMED。

（7）5%SDS聚丙烯酰胺（浓缩胶，6mL）：4.2mL水，1mL 30%丙烯酰胺溶液，0.76mL 1.0mol/L Tris（pH6.8），0.06mL 10%SDS，0.06mL 10%过硫酸铵，0.01mL TEMED；
（8）考马斯亮蓝染色液（1000mL）：450mL甲醇，450mL ddH2O，100mL冰乙酸，2.5g考马斯亮蓝R250；
（9）脱色缓冲液（1000mL）：450mL甲醇，450mL ddH2O，100mL冰乙酸。

（10）其它：预染蛋白质Marker，正丁醇。

3. Western Blotting相关试剂
（1）转膜缓冲液：称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加水至总量为1000 mL；
（2）洗涤液：含0.5％ Tween 20的TBS，TBS（pH8.0）：称取12.1g Tris碱，87.7g NaCl，充分溶解，调pH至8.0后，定容至10000mL；
（3）封闭液：牛血清白蛋白（BSA），使用前用TBST配制成1％溶液；
（4）一级抗体：兔抗人IgG免疫血清，使用前用TBST以1:40稀释；
（5）二级抗体：HRP标记的羊抗兔IgG，使用前用TBST以1:5000稀释；
（6）显色液：3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）显色试剂盒（Tiangen公司）；
（7）终止液：灭菌双蒸水
4. 实验用具：电泳仪，垂直平板电泳槽，电转膜仪，硝酸纤维素膜，whiteman滤纸，7cm平皿，水平摇床，移液器，吸头，天平。

二、实验步骤
1. SDS-PAGE
（1）夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板；
（2）配制12%的SDS丙烯酰胺分离胶10mL，灌入到两玻板的间隙中；
（3）在分离胶上加入正丁醇0.5mL，置37℃约30min；
（4）待分离胶聚合后，倾出覆盖层的正丁醇液体，用去离子水涮洗凝胶表面2～3次，用滤纸片吸净残留液体
（5）配制5%浓缩胶6mL，灌入分离胶上，立即插入梳子，置37℃约10min。

（6）待凝胶完全聚合后拔出梳子，固定于电泳装置。

加电泳缓冲液，直至盖住上样孔。