流式细胞仪

临床免疫学检验技术
目录
CONTENTS
第一章第二章第三章第四章流式细胞仪的原理
数据的显示与分析
流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞术在免疫检查中的应用
流式细胞仪的原理
概念
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术
分类流式细胞仪示意图
液流系统
作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区
流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。

作用：将产生的各种光信号成比例的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。

分类流式细胞仪工作原理示意图
基本工作原理细胞分选原理
分类488 nm 激光+
-前向散射光
检测器
荧光检测器电磁场单个细胞被分类
进入检测管
流式细胞仪分选系统
数据的显示与分析
01020304
参数散射光测定荧光测量数据显示方式
05
设门分析技术
参数
1、散射光信号：分为前向散射光（forward scatter，FSC）
和侧向散射光（side scatter，SSC）。

散射光不依赖于任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数，反映的是细胞的大小的
内部结构。

2、荧光信号
前向散射光示意图细胞大小
前向散射光检测器
侧向散射光检测器散射光检测
荧光测量
特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或
细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照
射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测
荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。

数据显示方式
单参数直方图、双参数直方图、三参数直方图、多参数组合分析
无害性
灵敏
度高
二维等高图
点图
流式细胞术的特点
灵敏度高无害性
速度快
灵敏度高
多参数
精度高纯度高
无害性
流式细胞仪免疫分析的技术要求
分类1.外周血单细胞悬液制备
2.培养细胞的单细胞悬液制备
3.新鲜实体标本单细胞悬液制备
4.石蜡包埋组织单细胞悬液制备
FCM
单细胞标本的制备
5.活检标本单细胞悬液制备
6.脱落细胞的单细胞悬液制备单次密度梯度离心法酶消化法表面活性剂处理法
分类
2.培养细胞的单细胞悬液制备
悬浮生长反复吹打
分散细胞
漂洗重悬
低速离心
贴壁生长
常规洗涤
细胞脱落低速离心蛋白酶消化
机械吹打
分类FCM 样品的荧光染色直接荧光染色间接荧光染色多参数分析时荧光抗体的组合标记
自发荧光
目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用
分类
免疫胶乳颗粒技术的应用
·液相芯片技术
利用胶乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和FCM ，实现对多种可溶性物质的分析。

低样本量、多参数、更高检测效率
流式细胞仪的质量控制
1.单细胞悬液制备的质量控制
2.免疫荧光染色的质量控制
3.仪器操作技术的质量控制
4.免疫检验的质量控制
流式细胞仪在免疫检查中的应用
淋巴细胞亚群分析
·T淋巴细胞及亚群分析
➢采用三色标记的单克隆荧光抗体，可对T细胞亚群进行分类。

➢Th细胞表达：CD3+CD4+CD8-
➢Tc细胞表达：CD3+CD4-CD8+
·B淋巴细胞及亚群分析
➢成熟B细胞主要表达CD19、CD20、CD21、CD22分子，同时检测CD25分子，可进一步观察B细胞活化状态。

·NK细胞分析
➢目前临床上常采用三色荧光抗体标记将CD3-CDl6+CD56+淋巴细胞定为自然杀伤细胞（Natutal killer cell，NK细胞）。

项目百分率(%)绝对数(个/μl)比值总T淋巴细胞(CD3+CD19-)50～84955～2860
总B淋巴细胞(CD3-CD19+)5～1890～560
辅助/诱导性T淋巴细胞(CD3+CD4+)27～51550～1440
抑制/细胞毒性T淋巴细胞(CD3+CD8+)15～44320～1250
辅助/抑制性T淋巴细胞比值(CD3+CD4+/ CD3+CD8+)0.71～2.78
NK细胞(CD3-CD16+CD56+)7～40150～1100 T淋巴细胞+B淋巴细胞+NK细胞95～1001530～3700
淋巴细胞功能分析
➢细胞介导细胞毒实验：淋巴细胞与靶细胞共培养，加入碘化丙啶（PI，渗透到死亡细胞致其染红色）
➢细胞内细胞因子测定：同时测定多种CK
白血病免疫表型分析
➢FCM对白血病复发的主要根源，微小残留病灶（MRD）
的检测具有高敏感性和特异性，早期检出MRD避免疾病复发。

典型AML的免疫表型特点
FAB分类CD13CD33CD11b CD14HLA-DR CD34CD117MPO
M0++/---++++
M1++-/+-++++
M2++--++/-++
M3++----++
M4+++++/-+/-++
M5a+++/-+/-+/-+-/+
M5b++++++-/+
M6+/-+/-+或
-+/--+
-
M7-+/---++?-
艾滋病的诊断与治疗
· 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的特征是CD4+ T淋巴细胞数量和功能的进行性破坏,从而引起全身继发严重感染和癌变。

FCM可以快速检测外周血CD4+ T和CD8+ T淋巴细胞相对数
和绝对数的变化，同时也可以检测CD4+ T细胞的功能变化。

血小板分析
➢FCM是当前血小板研究中不可缺少的检测工具，可用于检测血小板的多项指标。

➢对血小板相关的多种疾病诊断、治疗和预防，以及抗血小板活化药物的研究、评价及治疗监测等方面具有重要意义和研究价值。

网织红细胞分析
➢基本原理：用某种荧光染料与网织红细胞内的RNA结合，再通过流式细胞术检测被染色的网织红细胞数目。

➢噻唑橙(thiazole orange，TO)是目前用于FCM法分析网织红细胞最理想的一种染料。

PNH诊断
PNH患者其红细胞、粒细胞、淋巴细胞表面的CD55、CD59抗原明显减少或消失。

自身免疫性疾病HLA表型分析
检测原理：利用直接荧光标记法在外周淋巴细胞表面上标记抗HLA-B27的单克隆抗体，再通过FCM检测HLA-B27抗原的表达。

强直性脊柱炎
临床肿瘤学中的应用
➢肿瘤耐药相关分析：MDR多药耐药基因编码的亲脂化合物，淋巴细胞表达MDR，说明对化疗药出现耐药性。

➢FCM可以对细胞的DNA含量进行分析，确定肿瘤的恶性程度。

➢FCM还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的指导意义。

移植免疫中的应用
➢交叉配型：更灵敏、更快速，能同时检测细胞亚型、分辨出IgG和IgM抗体
➢群反应性抗体的检测
THE END
感谢聆听！。