聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法 实验报告
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dns氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离所得层析图与dns标准氨基酸层析图谱相对比可借此鉴定样品中氨基酸的种类用此法鉴定蛋白质n末端氨基酸比fdnb法灵敏1001010109mo1样品即可检出产物也比dnp氨基酸稳定且操作简便快速
生物化学实验报告
题目：聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法
姓名：余振洋学号：200900140156系年级：09级生科3班
查阅资料得到以下几条结论：
1. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
2.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。
2. 展层速度要快，单析（ 7×7cm ）一般只需 15 -20min。
3. 不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响其实验结果。
4．被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有差异。
5．展层剂的组成应该是固定的，因此配制时各组分比例要正确。
6．展层剂的纯度要注意，一般溶剂采用分析纯试剂即可，必要时可精制后使用。
同组者：张刚刚时间：2011/4/16
一．【实验目的】
1.了解并掌握DNS-氨基酸制备和鉴定的原理及方法。
2.掌握聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸的操作和方法。
二．【实验原理】
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（5-dimethylamino-1-naphthylene sulfonyl chloride，Dansyl ch1oride，简称DNS-Cl）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄色荧光的 DNS- 氨基酸。
六．【实验结果】
1.绘图
图一 DNS氨基酸聚酰胺薄膜层析结果（1. DNS-Ala 2.DNS-Phe 3.DNS-Lys
4.DNS-双-Lys）
2.Rf值的计算：
Rf=
注：上式中x代表色斑中心至原点中心的距离，Y代表展层剂前缘至原点中心的距离。其中，Y值经测量，统一为5.7cm。
在混合氨基酸中：
1.对于丙氨酸：X1=3.50cm，则Rf1 =0.61
二．影响Rf值的因素
Rf值是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数，定义为溶质迁移距离与流动相迁移距离之比。一般来说，每种物质都有其固定的Rf值。它的影响因素主要有下：
1.物质结构：
极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。
取4只离心管，分别加入标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及混合氨基酸30μl，再各加入DNS—Cl丙酮溶液30μl，混匀后放入37℃恒温水浴中保存1h。
2.点样
取聚酰胺薄膜一张，在距离一端1cm处用铅笔画一直线，在直线上取间距1cm的四点，作为点样原点。用毛细管取上步制得的DNS-氨基酸液进行点样，点样直径不超过2mm，重复2—3次，每次点样后用冷风吹干再点下一次，吹干。
聚酰胺薄膜。
容量瓶（100ml）。
移液管（2ml）。
培养皿,移液枪,移液管。
2.试剂：
①DNS—Cl丙酮溶液：称取25mg DNS—Cl溶在10ml丙酮中。
②展层液：甲酸∶水=1.5:100（V/V）。
③氨基酸样品：标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及混合氨基酸液。
四．【实验步骤】
1.DNS-氨基酸的制备
在DNS-Cl过量时，又会产生DNS-NH2，反应式如下：
在紫外光照射下，DNS-OH 和DNS-NH2产生蓝色荧光，而 DNS- 氨基酸产生黄色荧光，可彼此区分开。
三．【实验材料】
1.器材：
小离心管
紫外灯（波长254nm或265nm）。
37℃恒温水浴。
电吹风。
层析缸（10cm×20cm）。
毛细管（点样管）。
3.展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。
什么要求，应具备什么特点？
1. 能与不同的氨基酸形成不同程度的氢键，从而造成吸附力的差异，即展层速度的快慢，最终保证展层过程顺利完成。
3.展层
将上述聚酰胺薄膜光面向外卷曲（两边不接触）外扎以牛皮筋，直立于盛有
展层液12-13ml的培养皿盖或10ml的培养皿底中，盖上500ml 烧杯。当展层剂上升到距离顶端大约0.5cm时结束，取出，冷风吹干。
4.结果观察
将聚酰胺薄膜置于紫外灯下，观察荧光斑点，区分DNS-氨基酸，DNS-NH2与DNS-OH，用铅笔在黄绿色斑点边缘轻轻画图做记号，将样品图谱与标准图谱对比找出各种氨基酸相应的位置。
3.点样点间距不能太小，以免相互干扰；点样点距薄膜边缘不能太近，否则会产生边缘效应。
4.每次点样后，立即吹干，才可进行下一次点样，否则液体扩散，点样面积过大，影响展层效果。
5.展层剂液液面要低于点样点，但也不能太低。
6.紫外光对人体有害，因此要尽量缩短在紫外灯下的观察时间，注意不要把头伸到灯下观察。
3.点样时若两点之间间隔过小，使得点样点之间相互影响，从而影响了最终实验结果，本次实验宜控制在1cm左右。
4．展层剂液面高于点样点，使得DNS-氨基酸部分溶解在了展层液里，影响了最终结果。
5．用铅笔画起始的横线时，力度过大，形成了一条凹槽，对于层析会有不同程度的阻碍作用。
图中，赖氨酸有两个黄绿色荧光斑点，说明它和DNS-Cl反应有两种产物。这是因为：Lys含有两个氨基，因此Lys带有两个黄绿色荧光标记。又由于DNS-Cl主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的δ-氨基反应后的DNS-Lys。
五．【注意事项】
1.在DNS-氨基酸制备时，DNS化必须在碱性条件下（pH9.0左右）进行，否则会有很多副产物DNS—NH2或DNS—OH产生。
2.点样点要小、圆、量要适当，否则拖尾，因此毛细管要细，头要平，点上后立即拿开，样品浓度要合适，聚酰胺薄膜要选择优质的。点样直径不宜超过2mm，点样后立即吹干，同时点样力度不宜过大，防止把薄膜穿透而影响最终结果。
4.滤纸：
滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。
5.温度：
Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。
同时可以看到，薄膜上代表同一氨基酸的荧光点的位置并不完全在同一水平线上，而相互有错落，造成这种现象的原因可能有：
1.点样时用力过大，导致聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导致心形黄绿色荧光斑出现。
2. 点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，所以要严格控制点样点的大小，最好不要超过2mm；同时点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足或者没有点上。
2.溶质与溶剂间的相互作用：
这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。
3. pH值：
这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离，所得层析图与DNS-标准氨基酸层析图谱相对比，可借此鉴定样品中氨基酸的种类，用此法鉴定蛋白质N-末端氨基酸比FDNB法灵敏100倍，仅 10-10～10-9mo1样品即可检出，产物也比DNP-氨基酸稳定，且操作简便、快速。
DNS-Cl在pH值过高时，会水解产生副产物DNS-OH，反应时如下：
2.对于苯丙氨酸：X2=1.50cm，则Rf3 =0.26
3.对于赖氨酸：X3=0.90cm，则Rf3=0.16
X4 =4.50cm，则Rf4 =0.79
各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。
七．【结果分析及讨论】
从上述实验结果可以分析出：混合氨基酸中同时含有赖氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三种氨基酸。
生物化学实验报告
题目：聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸——DNS-Cl法
姓名：余振洋学号：200900140156系年级：09级生科3班
查阅资料得到以下几条结论：
1. DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
2.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。
2. 展层速度要快，单析（ 7×7cm ）一般只需 15 -20min。
3. 不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响其实验结果。
4．被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有差异。
5．展层剂的组成应该是固定的，因此配制时各组分比例要正确。
6．展层剂的纯度要注意，一般溶剂采用分析纯试剂即可，必要时可精制后使用。
同组者：张刚刚时间：2011/4/16
一．【实验目的】
1.了解并掌握DNS-氨基酸制备和鉴定的原理及方法。
2.掌握聚酰胺薄膜层析法分离氨基酸的操作和方法。
二．【实验原理】
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（5-dimethylamino-1-naphthylene sulfonyl chloride，Dansyl ch1oride，简称DNS-Cl）在弱碱性（pH9.0 左右）条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成带黄色荧光的 DNS- 氨基酸。
六．【实验结果】
1.绘图
图一 DNS氨基酸聚酰胺薄膜层析结果（1. DNS-Ala 2.DNS-Phe 3.DNS-Lys
4.DNS-双-Lys）
2.Rf值的计算：
Rf=
注：上式中x代表色斑中心至原点中心的距离，Y代表展层剂前缘至原点中心的距离。其中，Y值经测量，统一为5.7cm。
在混合氨基酸中：
1.对于丙氨酸：X1=3.50cm，则Rf1 =0.61
二．影响Rf值的因素
Rf值是色谱法中表示组分移动位置的一种方法的参数，定义为溶质迁移距离与流动相迁移距离之比。一般来说，每种物质都有其固定的Rf值。它的影响因素主要有下：
1.物质结构：
极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。
取4只离心管，分别加入标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及混合氨基酸30μl，再各加入DNS—Cl丙酮溶液30μl，混匀后放入37℃恒温水浴中保存1h。
2.点样
取聚酰胺薄膜一张，在距离一端1cm处用铅笔画一直线，在直线上取间距1cm的四点，作为点样原点。用毛细管取上步制得的DNS-氨基酸液进行点样，点样直径不超过2mm，重复2—3次，每次点样后用冷风吹干再点下一次，吹干。
聚酰胺薄膜。
容量瓶（100ml）。
移液管（2ml）。
培养皿,移液枪,移液管。
2.试剂：
①DNS—Cl丙酮溶液：称取25mg DNS—Cl溶在10ml丙酮中。
②展层液：甲酸∶水=1.5:100（V/V）。
③氨基酸样品：标准丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及混合氨基酸液。
四．【实验步骤】
1.DNS-氨基酸的制备
在DNS-Cl过量时，又会产生DNS-NH2，反应式如下：
在紫外光照射下，DNS-OH 和DNS-NH2产生蓝色荧光，而 DNS- 氨基酸产生黄色荧光，可彼此区分开。
三．【实验材料】
1.器材：
小离心管
紫外灯（波长254nm或265nm）。
37℃恒温水浴。
电吹风。
层析缸（10cm×20cm）。
毛细管（点样管）。
3.展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。
什么要求，应具备什么特点？
1. 能与不同的氨基酸形成不同程度的氢键，从而造成吸附力的差异，即展层速度的快慢，最终保证展层过程顺利完成。
3.展层
将上述聚酰胺薄膜光面向外卷曲（两边不接触）外扎以牛皮筋，直立于盛有
展层液12-13ml的培养皿盖或10ml的培养皿底中，盖上500ml 烧杯。当展层剂上升到距离顶端大约0.5cm时结束，取出，冷风吹干。
4.结果观察
将聚酰胺薄膜置于紫外灯下，观察荧光斑点，区分DNS-氨基酸，DNS-NH2与DNS-OH，用铅笔在黄绿色斑点边缘轻轻画图做记号，将样品图谱与标准图谱对比找出各种氨基酸相应的位置。
3.点样点间距不能太小，以免相互干扰；点样点距薄膜边缘不能太近，否则会产生边缘效应。
4.每次点样后，立即吹干，才可进行下一次点样，否则液体扩散，点样面积过大，影响展层效果。
5.展层剂液液面要低于点样点，但也不能太低。
6.紫外光对人体有害，因此要尽量缩短在紫外灯下的观察时间，注意不要把头伸到灯下观察。
3.点样时若两点之间间隔过小，使得点样点之间相互影响，从而影响了最终实验结果，本次实验宜控制在1cm左右。
4．展层剂液面高于点样点，使得DNS-氨基酸部分溶解在了展层液里，影响了最终结果。
5．用铅笔画起始的横线时，力度过大，形成了一条凹槽，对于层析会有不同程度的阻碍作用。
图中，赖氨酸有两个黄绿色荧光斑点，说明它和DNS-Cl反应有两种产物。这是因为：Lys含有两个氨基，因此Lys带有两个黄绿色荧光标记。又由于DNS-Cl主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的δ-氨基反应后的DNS-Lys。
五．【注意事项】
1.在DNS-氨基酸制备时，DNS化必须在碱性条件下（pH9.0左右）进行，否则会有很多副产物DNS—NH2或DNS—OH产生。
2.点样点要小、圆、量要适当，否则拖尾，因此毛细管要细，头要平，点上后立即拿开，样品浓度要合适，聚酰胺薄膜要选择优质的。点样直径不宜超过2mm，点样后立即吹干，同时点样力度不宜过大，防止把薄膜穿透而影响最终结果。
4.滤纸：
滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。
5.温度：
Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。
同时可以看到，薄膜上代表同一氨基酸的荧光点的位置并不完全在同一水平线上，而相互有错落，造成这种现象的原因可能有：
1.点样时用力过大，导致聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导致心形黄绿色荧光斑出现。
2. 点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，所以要严格控制点样点的大小，最好不要超过2mm；同时点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足或者没有点上。
2.溶质与溶剂间的相互作用：
这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。
3. pH值：
这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法分离，所得层析图与DNS-标准氨基酸层析图谱相对比，可借此鉴定样品中氨基酸的种类，用此法鉴定蛋白质N-末端氨基酸比FDNB法灵敏100倍，仅 10-10～10-9mo1样品即可检出，产物也比DNP-氨基酸稳定，且操作简便、快速。
DNS-Cl在pH值过高时，会水解产生副产物DNS-OH，反应时如下：
2.对于苯丙氨酸：X2=1.50cm，则Rf3 =0.26
3.对于赖氨酸：X3=0.90cm，则Rf3=0.16
X4 =4.50cm，则Rf4 =0.79
各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。
七．【结果分析及讨论】
从上述实验结果可以分析出：混合氨基酸中同时含有赖氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸三种氨基酸。