基因工程核酸杂交培训课件

HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
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第一节 工具酶 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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第一节 工具酶
一．限制性核酸酶内切酶 二．DNA聚合酶 三．DNA连接酶 四．碱性磷酸酶 五．核酸酶S1
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载体包括克隆载体和表达载体。
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第二节
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载体
常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒 和病毒等。 载体大都经过改造，如质粒改造后携带某些选择 性标记和克隆位点的遗传信息；噬菌体改造后 只保留同一种限制酶的单个或两个切点。在常用 的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件 （DNA序列）即为表达载体，它不仅可携带外源 基因片段进入宿主细胞，而且可在宿主细胞中表 达外源基因。
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四、 碱性磷酸酶
催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团， 其主要用途有： 1)除去DNA片段上的5磷酸，以防自身连接。 2)在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，
除去RNA或DNA上5端的磷酸。
一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65 kd，最佳 作用温度是70~80℃，Taq酶具有5→3 聚合酶活性 和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性。
Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过PCR对 DNA分子的特定序列进行体外扩增。
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3
3 5
3 5
3 5
RDDP
RNase
DDDP
（逆转录酶） （核酸酶H活性) （DNA聚合酶活性）
引物、4种dNTP
4种dNTP
5
5 3
5 3
5 3
RNA
RNA-DNA
(用
表示) 杂化分子
与病毒RNA 互补的DNA (complementary
有
有
特异识别位点
DNA链上的 无 特异切割位点
在识别序列内 在识别序列外
在分子克隆中 无
有
无
的重要意义
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一、限制性核酸内切酶
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五、 核酸酶S1
核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNARNA杂交分子中的单链部分。
其主要作用有： ①除去粘性末端以产生平末端。 ②除去cDNA合成时形成的发夹结构。 ③分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子
nppi
Co2+
5′
3O′H
dZNheTjiPang Provnpinpcial K5e′y Lab of3M′e(dAic、alGG、eneCti、csT)n
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三、 DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶两种类型， 分子量分别为7500和6000，两者的辅基不同， 前者需NAD+，后者需ATP。 它们催化的反应也不尽相同，大肠杆菌DNA连接 酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接 粘性末端，又能连接平末端。
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三种限制性核酸内切酶的作用
作用 Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
酶活性 核酸内切酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶
核酸内切酶 核酸内切酶 甲基化酶
DNA链上的 无
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二、DNA聚合酶
1、DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段
35kD (小)
68kD(大)
N 5→3外切酶
(103kD)
5→3聚合酶 3→5外切酶
枯草杆菌 蛋白酶
Klenow 片段
(68kD)
N 5→3聚合酶
C 3→5外切酶
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3、 逆转录酶
依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、 4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主 要。有： 1)逆转录作用； 2)核酸酶H的水解作用； 3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。
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一、限制性核酸内切酶
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶定义
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序 列的核酸水解酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
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二、DNA聚合酶
1、DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段
DNA-polⅠ是单一肽链的多功能酶， 分子量为103kd，它具有3种酶活性： 1)5→3聚合酶活性； 2)3→5核酸外切酶活性； 3)5→3核酸外切酶活性。
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Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
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一、限制性核酸内切酶
DNA，cDNA )
(用
表示)
病毒双链DNA
（cDNA第二链
用
表示）
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4、 末端脱氧核糖核苷酰转移酶
分子量为60 kd，在二价阳离子存在下，催化脱 氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3 末端-OH上。
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二、DNA聚合酶
1、DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段
Klenow片段的主要功能有： 1)补齐双链DNA的3末端，同时可使
3末端DNA标记同位素； 2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二链； 3)DNA序列分析。
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2、 Taq DNA聚合酶
+
核酸酶S1
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第二节 载体
载体（vector）:
指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或 表达的工具。载体的本质为DNA。
制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的 载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行 复制和表达。
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的主要用途
1）在分子克隆过程中切割DNA以获取目的基因片段、 切割载体形成切口，使目的基因能插入载体。
2）分析限制性片段长度多态性（RFLP），用于遗传 病的诊断，法医DNA指纹分析等。
3）用于构建DNA的物理图谱、基因定位及DNA同源 性分析等。
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三、 DNA连接酶
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功能主要有： 1)在载体或目的基因 3末端加上互补的同质多聚 尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。 2)用于DNA 3末端的同位素探针标记 。
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主要内容
第一节 工具酶 第二节 载体 第三节 分子克隆的基本步骤 第四节 基因工程的应用
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二、DNA聚合酶
DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 Taq DNA聚合酶 逆转录酶 末端脱氧核糖核苷酰转移酶
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的杂交情况。
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五、 核酸酶S1
功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体 中的单链部分。
核酸酶S1
核酸酶S1
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基因工程（gene engineering ）：又称为重组DNA技 术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞， 并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。
分子克隆（molecular cloning ）:是指在体外将制备 的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在 受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量 拷贝的技术。
（1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+。
5′
3′
Mg2+
5′
3′
OH
(A、G、C、T)n
dNTP
nppi
5′
OH
Mg2+
3′
5′
(A、G、C、T)n 3′
dNTP
nppi
（2）底物是平端或3凹端的双链DNA，需要Co2+。
5′
3′
OH
Co2+
5′
3′
(A、G、C、T)n
பைடு நூலகம்
dNTP
第二节载体zhejiangprovincialkeylabmedicalgenetics酵母穿梭载体示意图酵母穿梭载体示意图酵母复制起始区酵母yrp型穿梭载体amp细菌复制起始区转化大肠杆菌amp细胞转化酵母leu细胞质粒可在大肠杆菌和酵母之间穿梭zhejiangprovincialkeylabmedicalgeneticszhejiangprovincialkeylabmedicalgenetics第三节分子克隆的基本步骤zhejiangprovincialkeylabmedicalgenetics连接含重组子的阳性克隆载体目的基因转化筛选和鉴定阳性克隆dna重组体受体细胞dna分子克隆的基本步骤分切接转筛第三节分子克隆的基本步骤zhejiangprovincialkeyla接从染色体dna中分离目的基因第三节分子克隆的基本步骤zhejiangprovincialkeyla