25-羟基维生素D化学发光定量免疫分析方法的建立

D２、
２５
Ｇ(
OH)
D３、全氟辛酸等购自
做为解离剂,
１００μL 解离剂与 ２０μL 样本在反应杯中
３７℃ 温浴 ５ mi
n,选 择 两 个 浓 度 样 品,分 别 为 ０ 值 去
１．
２ 主 要 试 剂 抗 ２５
Ｇ(
OH)
D 绵羊单抗购自
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州长光 华 医 生 物 医 学 工 程 有 限 公 司 );
LC
ＧMS/MS
/LpH９．
/mL;按
采用 ０．
０５ mo
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５ CB 调 整 浓 度 为 １mg
/L NaOH.
HNO３ ＋１％ 过 氧 化 氢;底 物 ２ 为 ０．
１mo
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注意避光保存.
２．
３ 校准品的配制 取来自S
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D３,
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DOI:
１０．
１１７４８/b
．
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n．
１００６－１７０３．
２０２１．
０１．
０２７
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收稿日期:
２０２０
Ｇ０４
Ｇ２１;修回日期:
２０２０
Ｇ０７
Ｇ２１
基金项目:国家科技支撑计划(编号:
EP１７
ＧA),同 一 台 仪 器
同一批次试剂连续 ５d 检测 S０ 校准品,每天检测 １２
１２９
标记免疫分析与临床 ２０２１ 年 １ 月第 ２８ 卷第 １ 期
孔,共计 ６０ 次测试;将数据从 小 到 大 排 列,按 非 参 数
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e 公 司;去 类 固 醇 激 素 血 清 来 自 美 国
SCANTIBODIES 公司;抗链霉亲和素磁颗粒来自安
捷伦;吖碇酯来自深圳美凯特;标准物质 SRM９７２ 来
自 NI
ST;其他试剂均为分析纯.
量高 [４].
各种 ２５
Ｇ(
OH)
D 免疫检测试剂差异很大,从样本
、
准备阶段[
如从 VDBP 中完全连续地释放 ２
５
Ｇ(
OH)
D]
结合系统(单抗、多抗还 是 VDBP)、检 测 系 统(酶、荧
光物质、发光 物 质 等)、信 号 系 统 (如 光 吸 收、化 学 发
光、放射标记 等),各 种 方 法 间 的 差 异 导 致 各 实 验 室
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争法原理.在一次性反应杯中加入 ２０μL 样本、
１００μL
解离剂和 １００μL 吖啶酯标记的抗Ｇ２５
Ｇ(
OH)
D 单克隆
抗体,
３７℃ 下孵育１０mi
n,样本中２５
Ｇ羟基维生素 D 通
过解离剂的作用从维生素 D 结合蛋白上分离出来,与
抗Ｇ２５
Ｇ(
OH)
D 单克隆抗体反应,形成抗原Ｇ抗体复合
体;加入 １００μL 生物素化 ２５
Ｇ(
OH)
D 的 应 用 日 趋 广 泛,常 使 用 的 检
测方法分为 两 类:竞 争 法 或 蛋 白 结 合 免 疫 法 及 色 谱
法.高效 液 相 色 谱(HPLC)和 LC 质 谱(
LC
ＧMS)联
用的 LC
ＧMS/MS 为金标准,然而此方法专业水平要
求 极 高、费 时 费 力. 相 反,免 疫 方 法 相 对 简 单、通
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０ng/mL;批内不精密度不超过 ５％ ,批间不精
密度不超过 １０％ ;在线性范围为 ６~２００ng/mL;与金标准 方 法 LC
ＧMS/MS 相 比,相 关 性 在 ０．
９７ 以 上,偏 差 在 ±３０％ 内,
无系统偏差.结论 该 ２５
Ｇ(
OH)
D 化学发光定量检测方法,性能优异,适合临床推广使用.
１．
３ 标 本 来 源 随 机 选 取 正 常 健 康 人 血 清 样
本 ６８６ 例,收集时间为 ２０１７ 年 ３ 月 至 ２０１８ 年 １ 月,
/LPBS＋１０％
２．
５ 解离剂浓度选择 用 ０．
１mo
l
乙二醇 为 基 础 液,配 制 ０．
５％ ~８％ 浓 度 的 全 氟 辛 酸
关键词:
２５
Ｇ羟基维生素 D; LC
ＧMS/MS; 吖碇酯化学发光; ２４,
２５
Ｇ二羟基维生素 D
中图分类号:
R４４６．
６１ 文献标识码:
A
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２０１５BAK４５B０１)
通讯作者:颜光涛,研究员,研究方向:标记免疫分析技术.E
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２０２１,
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维生素 D(
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VD)是一种类固醇类衍生
物,在骨和 矿 物 质 代 谢 中 发 挥 重 要 作 用 [１]. 人 体 通
均来自健康体检人群,体检 结 果 均 无 肝、脑、肾、呼 吸
环转运至肝脏 并 转 化 成 ２５
Ｇ羟 基 VD[
２５
Ｇ(OH)
D],
避免反复冻融.
过自身合成及从食物中获 取 的 VD 在 体 内 经 血 液 循
道、消化道疾病,无补充维生素 D.１５２ 例血清样本,
测值范围在 ６~２００ng/mL.样本放置 －２０℃ 保存,
２５
Ｇ(
OH)
２D、
２D 的 半 衰 期 分 别 为
１５h、
３ 周、
４h 和 ７d. 一 般 而 言,血 清 中 ２５
Ｇ(OH)D
是由 ２５
２５
Ｇ(
OH)
D
Ｇ(
OH)
D３ 构成的,
Ｇ(
OH)
D２ 和 ２５
半衰 期 长 且 波 动 小,是 人 体 维 生 素 D 状 态 的 最 好 的
指标 [３].
检测 ２５
１２７
标记免疫分析与临床 ２０２１ 年 １ 月第 ２８ 卷第 １ 期
方法研究

２５
Ｇ羟基维生素 D 化学发光定量免疫
分析方法的建立
周齐洋１ ,徐海伟２ ,梁 辰３ ,冯 杰３ ,颜光涛３
(
江苏省医疗器械检验所,江苏 南京 ２１００１２;
方法比 对 存 在 困 难 [５]. 目 前 国 际 标 准 品 已 建 立 起
来,为消除 方 法 间 差 异 打 下 基 础 [６]. 本 研 究 建 立 了
一种吖碇酯化学发 光 定 量 检 测 ２５
Ｇ(
OH)
D 的 方 法,
报道如下.
材料和方法
１ 实验仪器和材料
１．
１ 主 要 仪 器 AEＧ１８０ 化 学 发 光 分 析 仪 (苏
激素血清与 ５０ng/mL２５
Ｇ(
OH)
D３ ,按上述方法双孔
操作后记录发光平均值.
３ 方法学鉴定
３．
１ 空 白 限 建 立 参 考 美 国 临 床 实 验 室 标 准
化 协 会 ( Cl
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Ｇ(
OH)
D 和 ２０μL 链霉亲
和素包被的磁颗粒,在３７℃ 下孵育１０mi
n,未结合样本
中 ２５
Ｇ(
OH)
D 的吖啶酯标记抗Ｇ２５
Ｇ(
OH)
D 单克隆抗
体与生物素化 ２５
Ｇ(
OH)
D 反应形成抗原抗体复合体,
同时在链霉亲和素和生物素 相 互 作 用 下 与 磁 微 粒 形
成固相;将反 应 液 置 于 一 个 磁 场 内,检 测 中 的 磁 颗 粒
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用去 类 固 醇 激 素 血 清 稀 释 配 成 标 准 品,经 NI
ST 的
标准 品 标 化 后 浓 度 分 别 为:
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５０、
１００、
２００ng/mL,加 ０．
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n３００,置 于 －２０℃ 长 期
保存.
２．
４ 检测方法 ２５
Ｇ羟基 维 生 素 D 测 定 采 用 竞
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