悬铃木多倍体诱导的初步研究
植物多倍体的诱导
正常洋葱根尖细胞染色 体： 秋水仙素处理后洋 葱根尖细胞染色体：
2n=16
2n=8x=64 2n=4x=32
六、注意事项
1、秋水仙素为白色粉末，易溶于冷水、乙醇、甲醛中，有 剧毒，使用时要特别注意，切勿使药物进入眼内或口中 2、由于秋水仙素是剧毒，使用时，秋水仙素溶液浓度不能 过大，否则会杀死细胞，0.1%左右的浓度诱导效果最好。 3、最重要的是浓度的控制 不同植物多倍体育种所需秋水仙 素是不同的
三、诱发多倍体植物意义
• 在某些农作物中，随着染色体组数的增加可使经济性状发 生有利的变化。 例如：番茄2n=4x维生素C含量比2n=2x的 多一倍；2n=3x的西瓜，香蕉、菠萝无籽；2n=3x的杜鹃因 不育而花期特长。现代月季中2n=2x花朵直径约5cm， 2n=4x花朵直径约10cm，2n=6x花朵直径约15cm；2n=6x， 2n=8x的小黑麦在高寒地区仍能获高产，并且蛋白质含量 较高。 但是多倍性也有一定的负面效应，例如，结实率 和分蘖率下降等。 相对于植物，动物的多倍体利用比较 少，原因大概是倍性的变化影响着性决定。但是，2n=3x 的银鲫,可由近缘物种的精子激活营孤雌生殖。异育方正 银鲫就是2n=3x的孤雌生殖系。 • 多倍体已成功地应用于植物育种,用人工方法诱导多倍体, 可以得到一般二倍体所没有的优良经济性状,如粒长、穗 长、抗病性强等.三倍体西瓜、三倍体甜菜、八绘制你所看到的洋葱根尖处理与对照的细胞分裂中期染 色体图像 2.根尖经秋水仙素处理之后为什么会发生膨大?
植物多倍体的诱导及观察
一、实验目的 掌握植物多倍体人工诱导技术及多倍体鉴 定方法。了解人工诱发多倍体植物的原理、 方法及其在植物育种上的作用；观察多倍 体植物，鉴别植物染色体数目的变化及引 起植物其他器官的变异情况
山东省二球悬铃木遗传多样性初步研究
Ｍ ｅ ｎ Ｎ ｅ Ｓ ｇ ｎ ｉ ｅ ｓｔ ｓ ０ ３ ７ ｎ ａ ｈ ｎ ｏ ｉ ｅ ｓ ｔ ｎ ｅ ｓ ０ ４ ２ ５ Ｇｅ ｅ ｉ ｉ ｅ ｓｔ ａ ｉ ｅ ｅ ｄ ｖ ｒ ｉｙ ｗａ ． ９ ，ａ ｄ ｍｅ ｎ Ｓ ａ ｎ ｎ ｄ ｖ ｒ ｉｙ ｉ ｄ ｘ ｗａ ． ８ ． １ ｎ ｔ ｄ ｖ ｒ ｉｙ ｃ
关 键 词 ： 球 悬 铃 木 ； 传 多样 性 ； 二 遗 ＲＡＰ 分 子 标 记 Ｄ 中图分 类号 ：７ ２３ ０４ Ｓ ９ ． ７ ． 文献标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ １７ ６ （Ｏ Ｏ ０ —０ ９０ １ ０ －４ １ ２ １ ） ６０ ７ —５
Ｐ ｉ ｒ ａｙ ｉ ｏ ｎ ｔ ｖ ｒｉ ｆＰ ａ ａ ｕ ｃｒｆ ｌ ｎ Ｓ ａ ｄ ｎ ｒｖｎ ｅ ｒ ｍａ ｙＡｎ ｌｓ ｎ Ｇｅ ｅｉ Ｄｉｅｓ ｙｏ ｌ ｔｎ ｓ ｅｉ ｏｉ ｉ ｈ ｎ ｏ ｇＰ ｏ ｉｃ ｓ ｃ ｔ ａ ａ
同地 区材料 的 遗传 多样 性 不 同 ， 州和 济 南的 最低 ， 宁和 聊 城 的居 中， 坊 、 台和 临 沂 的 最 高。 德 济 潍 烟
利 用非加 权 绝 对算 术平 均 法进行 聚 类 分析 ， 果表 明 ： 结 大部 分 来 自相 同或 相 邻 地 区的材 料 聚在 一
起， 但也 有 些相 距较 远 的材 料聚 在 一起 。
ＬＩ ｉｋ Ｕ Ｌ — ｅ ，Ｗ ＡＮＧ ｉ ｎ ｇ Ｊ ａ — ｅ ，Ｚ ＨＡＮＧ ｅ — ｕ Ｗ ｎ ｈ ｉ ，ＣＡＯ ｉ － ｎ Ｔ ｅ ｌ ，Ｆ ｉ ＡＮ ｎ －ｕ 。 Ｙｉ ｇ ｌ ｎ
植物的多倍体诱导及其观察实验报告
植物多倍体的诱导及其鉴定一、实验目的1、通过实验，掌握化学诱导植物多倍体的原理以及方法，学习利用秋水仙素诱导植物多倍体的一般方法及多倍体诱导在植物育种上的意义。
2.学习利用细胞学方法观察鉴定多倍体的特点以及诱导染色体加倍后的细胞学表现，利用染色体分析的方法对多倍体的细胞做出准确判断。
二、实验原理生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，这是物种的基本特征之一。
多倍体是细胞中具有3个或3个以上的染色体组的生物体。
在植物育种上，利用多倍体可以改良作物的经济性状，同时还可以利用多倍体克服远缘杂交过程中的障碍。
利用一些化学因素诱导植物产生多倍体，秋水仙素是诱导多倍体形成最有效和常用的药品之一，利用秋水仙素处理正在进行有丝分裂的细胞，可以抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体形成受抑制，有丝分裂后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体。
因此在适宜浓度的秋水仙素作用下，它既可以有效的阻止纺锤体的形成，又不至于对细胞发生较大的毒害，因此，细胞经一定时期后仍可恢复正常，继续分裂，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞，并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。
将秋水仙素处理的植物根尖，制成临时装片，利用显微镜观察根尖分生区细胞中的染色体数目而确定是否形成染色体。
三、实验材料、器具及试剂1、实验材料：发芽的蚕豆，蚕豆幼苗2、实验器具：显微镜、解剖针、小试管、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、试管、培养皿、烧杯。
3、实验试剂：秋水仙素： 0.1%浓度。
卡诺固定液：3份95％酒精与1份冰醋酸配制而成。
1mol/l盐酸，45%醋酸，改良苯酚品红，70%酒精。
四、实验步骤1、取材：将种子消毒，并于无菌水中浸泡24小时后，将蚕豆种子（2n=16）培养在培养皿内的湿滤纸上，室温或28℃发芽，待胚根长达1~2cm时，取出萌发的种子，用自来水洗2~3次，备用。
2、预处理：将胚根长到1~2cm的蚕豆种子移到盛有0.1%秋水仙素的润湿的的吸水纸的培养皿内，室温下处理48h,待观察到根部有膨大时取出固定，与在水中进行培养的蚕豆种子（一般植物生长周期为17~18h）做对照。
园艺植物多倍体的诱导和鉴定 李腾飞
园艺植物多倍体的诱导和鉴定中荷1001 李腾飞一、多倍体的诱导：物理方法温度骤变、机械创伤、辐射处理等都有可能诱发多倍体的产生。
化学方法主要是利用秋水仙素诱导多倍体。
生物方法：有性杂交获得多倍体组织培养获得多倍体1、秋水仙素诱导多倍体：秋水仙素是从百合科植物秋水仙的器官和种子中提取出来的一种剧毒的植物碱。
纯品为无色或淡黄色针状结晶，熔点155℃，有苦味，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛。
通常用水或酒精作溶媒。
秋水仙素诱导多倍体的原理：秋水仙素与正在分裂的细胞接触后，可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向两极，从而产生染色体加倍的核。
适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的形成，但对染色体结构无明显影响。
处理的细胞在一定时间内可恢复正常，重新进行分裂。
诱导方法：①浸渍法：可用溶液浸渍幼苗、新梢、插条、接穗、种子及球根类蔬菜、花卉等材料。
为避免蒸发，宜加盖，避光。
一般发芽种子处理数小时至3d或多至10d左右。
秋水仙碱能阻碍根系的发育，处理后要用清水洗净后再播种。
发芽种子的胚根，处理后往往受到抑制，发根较慢，为利于根的生长，可在药液中添加适当生长素。
处理插条、接穗一般1-2d。
处理幼苗时，为避免根系受害，可将盆钵架起来倒置，使茎端生长点浸入秋水仙碱溶液中。
②涂抹法把秋水仙碱按一定浓度配成乳剂，涂抹在幼苗或枝条的顶端，处理部位要适当遮盖，以减少蒸发和避免雨水冲洗。
③滴液法对较大植株的顶芽、腋芽处理时可采用此法。
常用的水溶液浓度为0.1%~0.4%，每日滴一至数次，反复处理数日，使溶液透过表皮渗入组织内部。
如溶液在上面停不住时，可将小片脱脂棉包裹幼芽，再滴加溶液，浸湿棉花。
④套罩法保留新梢的顶芽，除去顶芽下面的几片叶，套上一个防水的胶囊，内盛有含1%秋水仙碱的0.65%的琼脂，经24h即可去掉胶囊。
这种方法的优点是不需加甘油，可避免甘油引起药害。
⑤毛细管法将植株的顶芽、腋芽用脱脂棉或纱布包裹后，将脱脂棉与纱布的另一端浸在盛有秋水仙碱溶液的小瓶中，小瓶置于植株旁，利用毛细管吸水作用逐渐把芽浸透，此法一般多用于大植株上芽的处理。
悬铃木研究进展
种进 行培 育研究 ，对 于悬 铃木 的 推广
与栽 培 和提升其 绿化 美化 价值 具有 重
要 的作用 。一 直 以来 ，许 多科 研 工作 者通 过许 多种不 同方 法来 改 良悬铃 木 落果 飞 毛的这种 特性 ，已取得 了一定
成 果 。周 业 恒 等 （ １ ９ ９ ３ ） 用钴６ ０ 处 理 悬 铃 木 的 种 子 和 芽 ，获 得 具 有 一 定 遗 传 稳
区等地 的绿化 美化树 种 ，被誉 为 “ 行 道树 之王” 。但是 ，悬铃木果实是 由多
数 小坚 果集合 成球 形 的聚花果 ，小坚 果基 部围有长绒毛 ，每 年４ — ６ 月老果脱
落 ，大量 的果 毛飘散 ，而且在 果 毛飘
散 的 同 时 ， 也 会 有 大 量 的 花 粉 随 着 当
定性 的不 育植株 ，但 是获 得 的悬铃 木 生 长速度 变缓 ，枝条 、叶 、芽 等器 官 均 发 生 了变 异 ，不 再适 合 做 行 道 树 。 通 过秋水 仙素 等处理 进行 染色 体加 倍 的方 法可 获得 四倍体 悬铃 木 ，为 获得
悬铃木研 究进展
河 南 农 业 职 业 学 院 摘源自张 守仕 刘 荣 宁
郑庵 镇 人 民政 府
王 利 锋
要： 悬铃木是世界各 大中城 市重要 的行 道绿化树种 ，被誉为 “ 行道树之 王” 。该树 种具有适应各种类型土壤及城 市环境 的能力 ，还
具有抵抗 各种 空气污染改善环境的能力 ，但 也具有因果毛和花粉产生的 负面作用。从悬铃木 的生物 学特性 、品种培育及 抗逆性等方面进行综
影 响 。 因 此 ，对 少 果 无 果 悬 铃 木 新 品
实验六 植物多倍体的诱导及其细胞学鉴定
实验六植物多倍体的诱导及其细胞学鉴定实验六植物多倍体的诱导及其细胞学鉴定实验六植物多倍体诱导和细胞学鉴定一、实验目的通过实验掌握植物多倍体的方法和技术，观察多倍体的特点和染色体加倍后的细胞学表现。
染色体分析用于准确判断多倍体细胞。
2、实验原理生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，这是物种的基本特征之一。
多倍体是细胞中具有3个或3个以上的染色体组的生物体。
自然界中有许多植物是多倍体，也是变异发生的重要途径之一。
多倍体在形态较二倍体植物个体大，叶片上的气孔也很大，较易辩认。
多倍体研究在育种具有重要的意义。
利用一些诱发因素可以人工诱导植物产生多倍体。
这些因素包括物理的因素、化学因素等。
其中最为有效是化学药品是秋水仙素，秋水仙素colchicine（c22h25o6n）是1937年发现的，是从百合科植物秋水仙的种子和球茎中提取出来的一种植物碱。
能够抑制细胞有丝分裂时形成的纺锤体，染色体虽然完成了复制，但是不能形成两个子细胞，因而使染色体的数目加倍。
含加倍的染色体的体细胞再分裂出来的子细胞，染色体数目都比原来的体细胞增加了一倍，就形成了一个多倍体植株。
三、实验试剂和用具秋水仙碱：浓度分别为0.02%、0.05%、0.1%。
卡诺固定液：3份95％酒精与1份冰醋酸配制而成。
龙胆紫溶液：将0.5g龙胆紫溶解于100ml和2%醋酸溶液中，制备0.5%龙胆紫溶液。
乙酸品红溶液：将1g品红与100ml冰醋酸混合，煮沸。
煮沸时，加入一颗生锈的钉子。
1%醋酸品红染料中加入少量铁，可提高染色效果。
搪瓷盘、镊子、剪刀、烧杯、培养皿、恒温水浴锅、纱布、试管。
四、实验材料促进发芽的玉米种子、幼苗等。
5、实验方法（一）玉米种子的处理和检测（1）玉米种子处理：浸种发芽的水稻种子秋水仙碱浓度分别为0.02%、0.05%和0.1%，浸种时间分别为12h、24h和48h。
浸泡后，用蒸馏水冲洗三次，并在皮氏培养皿中继续培养一周。
（2）、多倍体检测：剪取根尖（或胚芽）2-3mm,投入盛有10%hcl的培养皿中解离10min，再清水漂系2次。
植物多倍体诱导研究
植物多倍体诱导研究作者：宁强来源：《商情》2014年第26期【摘要】多倍体的研究一直是育种工作者热衷的方向，多倍体如何诱导也越来越深入，本文概括了植物在多倍体诱导的方法、生物学效应和发展趋势等方面的最新进展。
【关键词】多倍体，诱导多倍体(polyploid)现象在植物界中早已存在，特别是在有花植物中最为普遍。
据报道，自然界中大约30%~35%的被子植物，70%的禾本科植物属于多倍体，多倍体在植物的进化和新物种的形成过程中起着十分重要的作用。
多倍体果树一般具有生长健壮、枝粗、叶厚、果大、少籽或无籽、产量高、适应性强和抗逆性强等优点，因此，多倍体育种倍受果树育种学家青睐。
在多倍体育种的诸多途径中，诱变法由于具有周期短、见效快、省工省力等突出优点而成为许多育种学家的首选。
利用人为方法来诱发多倍体，己在不少生物中获得成功。
早期诱变多倍体的方法多采用摘心和高低温处理授粉后的幼胚等机械和物理方法，获得多倍体的频率极低。
自从1937年Blakes和Areny发现秋水仙碱的诱导效果以来，各国普遍采用化学诱变的方法。
到目前为止，育种学家已在梨、杏、桃、栗、树莓、醋栗、苹果、香蕉、葡萄、草莓、越桔、柑桔、菠萝、枣、猕猴桃、核桃等果树上成功地诱导出多倍体植株，大大丰富了世界各国的果树种质资源。
一、诱变技术（一）化学诱变剂的选择化学药剂中的对二氯代苯、8-OH喹啉(8－OHQ)、秋水仙碱(colchicine)等对植物分生组织均有加倍效应，另据国外一些资料报道，除莠剂在果树上也有很好的加倍效果，但目前应用最多的还是秋水仙碱。
秋水仙碱的作用在于抑制分裂细胞中纺锤丝的形成，使有丝分裂细胞停留在中期。
当秋水仙碱的作用被解除后，受影响的细胞就产生了加倍效应，而后经选择培育便可获得多倍体植株。
（二）诱变方法1、常规诱变法用秋水仙碱处理茎尖和正在发芽的种子是最为普遍的方法。
为防止药液蒸发过快，生长点上可加小棉球，并罩上塑料膜。
Lapins认为，用化学诱变剂处理幼芽和种子时，剥去鳞片和种皮可提高诱变效果。
人工诱导植物多倍体的方法初探
人工诱导植物多倍体的方法初探作者：张爱清来源：《中学生物学》2016年第04期摘要重点总结了植物多倍体人工诱变的物理、生物和化学方法，并从植物多倍体的来源、特点及意义等方面进行了补充介绍。
关键词人工诱导植物多倍体中图分类号 Q-49 文献标志码 E多倍体是指体细胞中含有三组或三组以上染色体的个体。
自然界广泛生存着多倍体植物，大约一半的被子植物，2/3的禾本科植物，80%的草类，18%的豆类是多倍体。
其中，以蓼科、景天科、蔷薇科、锦葵科、禾本科和鸢尾科中多倍体最多。
许多农作物及果树、蔬菜、花卉（如小麦、燕麦、棉花、马铃薯、甘蔗、花生、烟草、甘薯、苜蓿、山药、韭菜、荠菜、苦苣菜、香蕉、苹果、李、樱桃、梨、草莓、葡萄、菊、水仙、郁金香等）均为天然的多倍体。
1 多倍体植物的来源及特点多倍体的类型有同源多倍体和异源多倍体。
还有一些过渡类型或复合类型，如区段异源多倍体（BBB1B1）、同源异源多倍体（AAAABBBB）及倍半二倍体（ABB）等。
现已查明多倍体形成的细胞学机制，是由于细胞分裂时染色体不分离而引起。
大体有两种情况：①减数分裂时，全组或部分染色体没有减数，仍停留在一个细胞核里，从而形成二倍性的生殖细胞。
这种未减数的2n雄配子与带有2n的雌配子结合，发育成四倍体。
但由于2n雄配子在授粉过程中常竞争不过经减数分裂的雄配子（n），因而会出现未减数的雌配子与减数的雄配子相结合，形成天然三倍体植物。
②有丝分裂时，染色体虽然复制了，但细胞没有相应地发生分裂，从而使细胞核里包含了比原来多一倍的染色体，产生了多倍体。
总之，多倍体的产生是植物对不利条件的适应，是自然选择的结果，从而进化发展成新的变种或物种。
巨型性是同源多倍体主要形态特征之一。
细胞核和细胞体积（特别是保卫细胞）、叶片、厚度、气孔和花粉粒、花和种子、茎的粗度增大。
基因剂量倍增，从而使植物的一些生理生化过程加强，新陈代谢旺盛，其体内的某些生化成分的含量也相应提高。
植物多倍体的诱导及其细胞学鉴定
植物多倍体的诱导及其细胞学鉴定植物多倍体的诱导及其细胞学鉴定摘要多倍体诱发在植物乃至在动物中都已经有了很广泛的应用，此次实验通过对大蒜根尖细胞进行多倍体诱发，初步了解并掌握了仍诱导多倍体的方法和技术，并对诱导组织进行了染色和压迫观察，进行了细胞学鉴定，掌握了判断多倍体细胞的方法和技术。
1.引言多倍体这个名词在人们的日常生活中也许并不多见，但在自然界中多倍体的分布却十分广泛，人们平时的饮食生活中，也有多倍体的身影。
现已知自然界大约有30％~35％的被子植物，70％的禾本科植物属于多倍体，它们在植物进化中起了重要的作用，也是变异发生的主要途径。
而我们平时吃的山药是四倍体，小麦是异源六倍体，大豆是异源四倍体，香葱也是四倍体。
自然形成的多倍体大多是植物对恶劣的自然环境的适应，而自从1937年美国学者布莱克斯利（A.F.Blakeslee）等，用秋水仙素加倍曼陀罗等植物的染色体数获得成功以后，秋水仙素就被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种。
花卉方面：矮牵牛、金鱼草、鸡冠花等多倍体植物多表现为叶片肥厚、花色艳丽、花期长、花瓣多等特点，观赏价值得到了提高；药材方面，板蓝根四倍体有效成分含量比普通二倍体对照高出约40%；林木方面，四倍体桑树及刺槐在生长量及抗逆性方面都较之二倍体对照有了较大提高；经济作物方面，多倍体水稻的稻粒比普通水稻更加饱满、肥大。
另外，在倍性育种的过程中，育种家们还发现，植物多倍体除了适应性强、有机合成速率增加、果实大等优点外，还可克服远源杂交的不结实性和诱变率高的优点，由此可见，在人工诱导植物多倍体的基础上，如能结合其它育种手段，以培育出高质量的植物新品种，大有潜力可挖。
现在，动物多倍体诱变也逐渐发展起来，最显著的应用便是鲍的诱变。
人们发现，鲍的多倍体个体具有生长速度快、抗病力强、个体大等优点，具有明显的增产效果，极具推广价值。
而利用水压法、温度法等方法，也已经实现了工业化的批量生产。
最新高二生物-植物多倍体诱导育种研究进展 精品
植物多倍体诱导育种研究进展据统计，自然界大约有30％～35％的被子植物，其中70％的禾本科植物属于多倍体，它们在植物进化中起了重要的作用。
由于许多重要作物均是多倍体，因而，育种学家自30年代开始就热衷于多倍体诱导育种的研究。
随着对多倍体产生途径、特征、特性及鉴定方法等方面更为深入的研究，使多倍体诱导育种在育种领域显示出日益广阔的应用和发展前景。
本文就近年来在此领域所取得的成就做一概述。
1 多倍体产生途径自然界的多倍体在无性和有性阶段均可产生，无性阶段是体细胞分裂过程中偶然发生染色体加倍而造成，而有性阶段则是由于小孢子母细胞或大孢子母细胞在减数分裂过程中不减数产生了2n配子。
因此，人为地诱导体细胞不分裂和性细胞不减数是产生多倍体的有效途径。
1．1 无性阶段的诱导无性阶段的诱导可分为物理和化学诱导。
最早的物理诱导方式是在番茄上通过打顶而实现，后来人们利用高温或低温处理授粉后的幼胚，以及采用射线、中子、激光等辐照也实现了染色体的加倍。
但这些方法由于效率低等缺陷而未能普及，化学药品中的秋水仙素则克服了前述各种方法的缺陷，受到大多数育种学家的青睐。
秋水仙素诱导植物无性阶段产生多倍体，普遍采用浸种和滴涂生长点的方法。
早在1939年约翰斯通(Johnstone)就曾用0.15％和0.5％的秋水仙素浸泡马铃薯种子得到少量加倍植株，有效诱导率仅为0.1％～1％。
郭清泉等(1997)在研究莲时指出：莲种子长期浸泡易烂种；用注射器注秋水仙素入莲胚的方法由于难以找到生长点，针头刺伤胚易造成霉烂；点滴法则由于药液易滑落难于浸入生长点等造成多倍体诱导率低，而用溶有秋水仙素的琼脂凝胶包埋胚芽，使其诱导频率达46％，这是解决诱导频率低的一个重大突破。
但是，人们在研究中发现，这种在整体水平上染色体加倍的诱导，受环境干扰大，易产生嵌合体，并可能发生回复突变。
随着组织培养技术的发展，很多物种通过组培再生植株已经不存在障碍，这使秋水仙素在离体组织水平上诱导单个细胞内染色体加倍成为可能。
三球悬铃木体细胞同源四倍体诱导及鉴定
悬铃木研究进展
河南农业2015年第1期(下)悬铃木俗称“法桐”,在植物分类学上隶属于悬铃木科,该科是一个小科,只有1个属,约11种。
目前,世界各地均有悬铃木的栽培,我国各地引进并进行大量栽培的悬铃木科植物有三种,具体包括一球悬铃木、二球悬铃木和三球悬铃木(云南植物志,2003)。
悬铃木树型雄伟、冠大荫浓、树干通直、生长迅速、耐修剪、易繁殖,具有适应各种类型土壤及城市环境的能力,具有一定的抗有害气体(如二氧化硫、氯气等)以及抗光化学烟雾的能力,具有较好的抗空气污染能力,具有吸附尘埃、减少噪音的作用。
在全球亚热带、温带各大城市中,被广泛用作道路、街市、社区以及企业厂区等地的绿化美化树种,被誉为“行道树之王”。
但是,悬铃木果实是由多数小坚果集合成球形的聚花果,小坚果基部围有长绒毛,每年4-6月老果脱落,大量的果毛飘散,而且在果毛飘散的同时,也会有大量的花粉随着当年新生雄花序开放而散落。
这些问题不仅对环境造成了污染,而且还会引发一些呼吸系统疾病,对人们生活出行和身体健康产生一定影响,使悬铃木的栽培与推广受到严重限制。
为此,国内外众多研究者对悬铃木在生物学特性、新品种培育及抗逆性等方面做了多方探索,笔者就这一领域的研究进展做了综述,并对未来的发展前景进行了展望。
一、悬铃木生物学特性悬铃木属落叶乔木。
树皮表面平滑,呈灰绿或灰褐色,薄片状自然脱落。
枝叶表面被星状绒毛。
单叶具长柄,互生,呈掌状分裂。
花为雌雄同株,单性,头状球形花序,雄花序无苞片,雌花序有苞片具长柄。
头状花序于成果时扩大而硬形成果球(球形果序)。
果球通常1至3个生于长柄上,组成果球的小坚果呈狭长的倒锥形,其基部具长毛。
每个坚果均有1粒种子,薄胚乳,胚中的线形子叶呈不等形。
悬铃木是喜光树种,适宜在湿润温暖的环境中生长。
当前我国各地引进并大量栽培的三种悬铃木,在原产地、分布地区及生物学特性等方面存在不同。
一球悬铃木主要分布在我国中北部,原产北美;树皮呈浅灰褐色;叶片宽度大于长度,裂片呈宽三角形,3～6裂,以浅裂状居多,具粗齿,背面多绒毛;坚果先端呈钝形或截形,有棱角,果毛为坚果长度的一半;果序多为单生,无毛刺;花期4～5月,果期10～11月;有较强的抗干旱等抗逆性。
林木多倍体诱导的研究进展
*
诱导林木多倍体形成的机制 诱导林木多倍体形成的机制主要是包括体细
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胞加倍和配子染色体不减数二种方式 " 体细胞加 倍主要是对一些幼嫩的分生组织 !如幼苗或活跃的 顶端分生组织 ! 通过用化学药剂诱导或物理辐射 处理 ! 从而得到多倍体植株或嵌合体 " 其优点是后 代能够保持母本的性状 ! 缺点是容易产生嵌合现 象 " 配子染色体未减数是指通过改变温度或用化 学药剂等方式处理植株花芽 ! 获得未减数的孢子 $(/%! 再与正常的植株 $/% 杂交 ! 得到三倍体 $,/%! 或二倍体未减数的雌配子 $(/ % 与未减数的雄配子 $(/% 结合 ! 直接形成四倍体 " 这样可以获得纯合的 多倍体 ! 但后代个体之间基因型存在较大的差异 "
最初主要使用物理方法 ! 自 *+,- 年秋水仙碱在诱 导染色体加倍上的巨大效果被证实 &(’以来 ! 人工多 倍体的诱导进入了一个崭新的阶段 ! 林木多倍体 的诱导研究工作也因之广泛展开 ! 在随后的半个 多世纪中 ! 林木育种工作者在人工多倍体的诱导 研究中付出了大量的努力. 取得了巨大的成就 "
人工杂交 采用四倍体植株 " 然后再与二倍体交 配 产 生 三倍体 " 如 A.B.CD7DEFDG:HD33D!*,# 以巴西橡胶树二
23 处剪顶 "获得稳定的多倍体植株 #
第１期
谭德冠 等：林木多倍体诱导的研究进展
２９
倍体的 !"# 为母本 ! 与 四 倍 体 的 $$%%#&’ 杂 交 授 粉 !得到三倍体橡胶植株 " 由于这种方法的前提条 件是首先要培育出四倍体植株 ! 并待其长大开花 ! 才能通过杂交授粉来培育多倍体 ! 育种周期较长 ! 因而人们常利用天然的或理化诱导的 () 配 子 与 二倍体植株的 #) 配子杂交获取三倍体 ! 这样可大 大缩短多倍体的选育种年限 ! 如我国学者张志毅 等 用 &-#％ !&-’％!的 秋 水 仙 碱 处 理 发 育 至 一 定 阶
林木多倍体育种研究进展
第25卷 第4期2003年7月北 京 林 业 大 学 学 报JOURNAL OF BEIJING FORES TRY UNIVERSITYVol.25,No.4Jul.,20032003--02--17收稿http:P P *国家自然科学基金(30170782)及国家林业局重点项目(99--12)共同资助.作者简介:康向阳,男,1963年生,博士,教授.主要研究方向:林木倍性育种、细胞遗传学、生物技术.电话:010--62338105 Email:kangxy@b-j 地址:100083北京林业大学生物科学与技术学院.林木多倍体育种研究进展*康向阳(北京林业大学毛白杨研究所)摘要 该文综述了林木多倍体育种的途径、方法及其应用现状,指出多倍体育种在速生、优质、高抗逆性等林木新品种选育中具有更大的潜力;目前在林业生产中应用的多倍体新品种数量之所以相对较少,主要与树木细胞遗传等基础研究滞后、一些多倍体育种相关理论和技术难题未能得以攻克有关.而随着人类对其应用价值认识的提高以及有关新技术方法的注入,建立在现代遗传学以及细胞染色体工程技术基础之上的林木多倍体育种将焕发出新的生机与活力.关键词 林木,多倍体,育种中图分类号 S72213+5Kang Xiangyang.Advances in researches on polyploid breeding of forest trees .Journal o f Beijing Fo restry University (2003)25(4)70--74[Ch,56ref.]Institute of Populus tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China.The paper overvie ws the research methods and application status of polyploid breeding in forest trees.It shows that polyploid breeding has great potentiality in selecting ne w varieties with traits of fast gro wing,high quality and resistance.However,the numbers of new polyploid varieties used in the forestry production are re-l atively less.The main reasons are caused by the lag of basic researches in forest tree c ytogenetics,unresolved theoretic and technical problems related to the polyploid breeding.Following the increasing understanding on application values of polyploid and using of related ne w techniques,the polyploid breeding based on modern genetics and cell and chromosomal engineering will have ne w vitality and vigor.Key words forest tree,polyploid,breeding 染色体多倍化是植物进化最为重要的方式之一,其中约有30%~35%的被子植物经历过一次或数次多倍化事件形成多倍体[1].多倍体在自然界的广泛分布表明多倍化可以增强植物的适应性和竞争力,而人类也可以效法自然开展多倍体人工诱导及其利用工作.1935年,Nilsson_Ehle 在瑞典发现了一株叶片巨大、生长迅速的巨型三倍体欧洲山杨[2,3],引起了世界对多倍体应用价值的广泛关注,由此成为林木多倍体育种的开端.1937年,当Blakeslee 、Avery 采用曼陀罗等植物证实秋水仙素诱导植物多倍体的巨大效果之后,进一步掀起了世界性多倍体诱导研究的热潮,并获得了大量作物、果树、蔬菜、花卉等多倍体新品种[4--7].杨树、橡胶、桑树等一系列林木多倍体新品种的选育成功[8--16],为我们展示了日益广阔的发展前景.1 林木多倍体育种的作用植物细胞核内染色体组加倍以后,常常带来一些形态和生理上的变化,在提高生长速度、增进遗传品质以及提高目的代谢物含量等方面具有优势.就主要利用营养器官的林木多倍体育种而言,由于许多树种能够进行无性繁殖,可以不必担心多倍体育性差而导致繁殖困难的难题,而多年生习性又保证品种一旦育成就可以长期持续利用等,因此林木多倍体育种的潜力更大、作用更为突出.具体主要用于如下3个方面.111纸浆材等短周期森林工业用材新品种选育多倍体特别是异源多倍体在染色体加倍后可带来营养器官的巨大性变化,通过多倍体育种培育更为速生、优质的林木品种,可以缩短栽培利用周期,提高工业利用价值.如欧洲山杨@美洲山杨杂种三倍体的材积生长比本地生长的山杨快1~2倍,纤维长度长18%,比重高20%,是一种优良的纸浆原料[9--11].我国三倍体毛白杨系列新品种的材积生长较相同立地条件下的二倍体提高2~3倍,采伐周期缩短至5年;而纤维平均长度在5年生时就达1.28 mm,比同龄普通毛白杨长52%,且长度分布均匀,长宽比大,纤维细胞壁薄,壁腔比小,尤其适合纸浆材生产[16,17].112利用组织代谢产物的经济林木新品种选育由于多倍体的基因剂量倍增,从而使植物的一些生理生化过程随之加强,新陈代谢旺盛,其体内的某些生化成分的含量也相应提高.在林木育种中,多倍体育种可望使利用组织代谢产物的经济树种品质性状得到改善提高,如树木叶蛋白、橡胶以及黄酮等,从而提高林木的利用价值,降低生产成本.有关育种成果已经在生产中得到应用,其中四倍体橡胶树的产胶量比二倍体亲本提高34%[13];三倍体漆树的产漆量比二倍体高出1~2倍[18];三倍体桑树在产叶量和叶品质等方面均优于二倍体等[3,14,15].113抗逆性生态防护型林木新品种选育多倍体植物一般生活力强,对环境适应性亦强,抗旱、抗寒以及抗病虫害等优势明显.仅从植物地理分布上看,多倍体大多出现在高纬度、高海拔以及北极、沙漠等气候环境变化剧烈的地区,说明植物多倍体比通常的二倍体具有更强适应不利自然条件的能力[1,4].通过多倍体育种可提高林木的抗逆性,相应扩大树种的栽培条件与种植范围.如四倍体柳杉的耐寒性增强[6];三倍体欧洲山杨比较耐干旱瘠薄,更适宜于条件较差的山地栽植,而且还表现出较强的抗病能力[6,9];三倍体桦木表现对锈病的抗性增强等[19].2林木多倍体育种的途径与方法自然界植物多倍体的发生均来自于细胞核内染色体组的倍数变异,即体细胞分裂过程中偶然发生的染色体加倍以及减数分裂过程中产生未减数配子.当人类开始认识到多倍体的价值及其产生机制之后,伴随着科学与技术的进步,必然会进入人为创造与利用染色体倍性变异的阶段.211从自然界中直接选择天然多倍体多倍体在林木中也是普遍存在的,现已检出天然多倍体的树种有挪威云杉、北美乔柏、日本柳杉、日本扁柏、落叶松、桤木、白桦、欧洲白蜡、欧洲水青冈、花椒、椴树、合欢、桑树、漆树、柳树、欧洲山杨,香脂杨、银白杨、美洲山杨、毛白杨等[2,6,18--25].这些天然多倍体大多表现不如二倍体,但在某些树种中也不乏表现突出的个体,如天然三倍体漆树具有生长快、产漆量高等特点.欧洲山杨、美洲山杨天然三倍体与相同立地条件下的同龄二倍体相比,在生长及材质等方面均显示出较强的优势[2,6].而在我国检出的5个毛白杨天然三倍体中,大多则是早已被林业生产实践所证明的优良类型(如易县毛白杨雌株)[25].显然对于一些存在天然三倍体的树种而言,直接从种群内选择即可收到较好的效果,但由于在林木种群中天然多倍体的出现毕竟仍占少数,限制性难题是如何将这些多倍体从其巨大的种群中鉴定出来.212体细胞染色体加倍体细胞染色体加倍是人类最早选择获取多倍体的途径.有关研究表明,机械损伤、高温和低温、辐射、化学试剂等理化处理方法均可获得多倍体,其中以秋水仙素诱导效果最佳.在多倍体诱导过程中,应根据植物种的生物学特性、处理的材料及环境温度差异等,选取不同的处理方法和方式,掌握最佳处理时期,并适时调整处理剂量以及持续处理时间,可增进诱导效果[4--7].然而由于细胞分裂的不同步性,很难作到使所有的细胞染色体加倍,因此体细胞染色体加倍最终获得的大多是混倍体或嵌合体,影响了倍性优势的发挥.在林木中人工诱导获得的体细胞多倍体涉及杨树、桑树、橡胶、刺槐、桤木、桦木、相思、枸杞等树种[6,26--32],但迄今只有四倍体刺槐等少数几个品种在生产上成功应用,大多因生长等表现欠佳,主要用于作为育种和研究材料.其中值得提出的是在授粉后直接针对合子的染色体加倍,Einspahr 等(1965)将受精的美洲山杨雌花序浸在013%的秋水仙素溶液中处理24h,一次获得50株四倍体幼苗[32].该方法不但创造性地提高了多倍体诱导频率,而且更为重要的是由于处理仅涉及一个或数个细胞,避免了嵌合体的出现,可以获得真正的多倍体.213不同倍性体间杂交当某树种中存在有可育的不同倍性体时,利用不同倍性体杂交是获取新的多倍体最为简捷而有效的途径.Nilsson_Ehle(1938)最早用三倍体欧洲山杨与二倍体进行杂交试验,获得了一些三倍体、四倍和71第4期康向阳:林木多倍体育种研究进展混倍体植株[33].此后的众多研究表明,利用三倍体与二倍体杂交之所以能够获得多倍体,是由于在三倍体不规则的减数分裂中可以产生少量不同倍性的可育配子的缘故.通过不同倍性体间杂交途径已成功获得多倍体的林木包括杨树、桑树、桦木、桤木、刺槐、枸杞等[6,10,11,34--36].Einspahr等(1984)、Weisgerber 等(1980)利用四倍体欧洲山杨与二倍体美洲山杨杂交获得了异源三倍体山杨,为杨树纸浆材等森林工业用材新品种选育做出了巨大贡献[10,11].在北欧和美国的有些地区,甚至将四倍体山杨雌株直接栽在优良的山杨林分中自由授粉,每年在四倍体上采种育苗、造林.目前,利用该途径的多倍体育种大多仅限于群体中存在天然多倍体或已经获得人工多倍体的树种,这主要是因为树木生长周期长,而人工多倍体诱导本身就是一个技术性较强的工作,即使培育成功,还要等待开花结实,需时较长;况且这种多倍体还必须具有较好的育性,在与另一亲本交配时应表现出较高的配合力等,否则或不能取得杂交后代,或虽有子代产生但无优势而言,使育种陷于劳而无功的失败境地.214天然或人工未减数配子杂交直接利用天然未减数2n花粉进行多倍体育种的树种主要是杨树.国外在灰杨、香脂杨、黑杨杂种(Heidemj)等杨树中均发现有天然2n花粉,并用这些花粉进行授粉杂交得到了三倍体[6,36,37].朱之悌等(1995)利用毛白杨天然2n花粉与毛新杨、银腺杨杂交,最终获得了26株生长、材质俱优的异源三倍体,这些三倍体已经得到大面积推广应用,产生了巨大的经济、生态和社会效益[8,16].但并不是所有树种都会自然产生2n花粉,且2n花粉发生往往受树种自身遗传因素和外部环境的双重影响,具有偶然性、多变性,大多比率较低,因此其利用也就受到一定程度的限制.人工诱导花粉染色体加倍是树木人工多倍体育种中最为快捷的途径.Johnsson(1940)最早采用秋水仙碱处理欧洲山杨、美洲山杨雄花枝,取得了一些2n花粉,然后给雌花枝授粉,均得到了三倍体植株[38].此后在欧洲山杨、美洲山杨、美洲黑杨、香脂杨、银白杨、毛新杨、银腺杨、橡胶、桑树等树种中,均通过秋水仙素或高温等诱导方法进行了2n雌雄配子诱导,并与正常异性配子杂交得到了三倍体植株[39--49].其中,张志毅等(1992)应用秋水仙碱和高温等方法处理获得了毛新杨未减数2n花粉,并取得三倍体植株[43].康向阳等(1996)则在掌握杨树花粉母细胞减数分裂规律的基础上,明确了决定花粉染色体加倍效果的减数分裂有效处理时期;揭示了未减数2n花粉发育迟缓导致受精竞争能力差的原因;并证明了利用花粉倍性对辐射敏感性的差异增进2n 花粉参与受精竞争机率等,从而成功地建立了以细胞遗传学研究为基础,综合花粉染色体加倍、花粉辐射和杂交育种等技术,高效获得白杨杂种三倍体的育种技术体系,为三倍体大群体、强选择育种奠定了基础[8,44--48].有关研究表明,在进行人工诱导配子染色体加倍时,掌握树种的相关细胞遗传学知识可以取得事半功倍的效果.与利用2n花粉相比,由于利用2n雌配子不存在单倍性配子竞争问题,受精后可100%形成三倍体,因此采用2n雌配子选育三倍体更具诱惑力.其中,在树木中尚未见有关天然2n雌配子利用的研究.而在人工诱导2n雌配子方面,也仅在桑树与毛新杨等树种中有过尝试[40,49].与花粉染色体加倍相比,由于大孢子母细胞减数分裂进程不能即时观察,难以确定影响雌配子染色体加倍的减数分裂有效处理时期,因此,有关雌配子染色体加倍研究主要是通过对大批量材料的处理及筛选,工作量大,而三倍体得率却较低,且可重复性较差,从而限制了2n雌配子诱导及其育种应用.不言而喻,如能在利用2n雌配子相关机理和技术等方面取得突破,三倍体育种将会更为实用而有效.215胚乳培养与细胞融合在大多被子植物中,一个精核与两个极核融合完成双受精过程,从而产生三倍性的胚乳,因此通过某一树种的胚乳培养也可以获得三倍体植株.1973年,Srivastava首次由罗氏核实木的成熟胚乳培养中获得了三倍体胚乳再生植株.此后胚乳培养研究进展迅速,其中有关林木胚乳培养的研究大多集中在经济树种中,主要在猕猴桃、枸杞、枣等胚乳培养方面取得三倍体苗木[50--53].目前胚乳培养的主要问题是由于愈伤组织继代培养中往往会产生染色体变异,从而造成再生植株多为非整倍体、混倍体,甚至恢复为二倍体等.相信该问题将会随着胚乳培养技术的进步而得到解决.细胞融合能够获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体,可以说是克服植物远缘杂交障碍、创造多倍体的又一条新途径.1960年,Cocking发明了用酶去除植物细胞壁获得原生质体的方法,为植物细胞杂交奠定了基础.此后,随着原生质体化学融合和电融合技术的发展,已有近百种内、种间和属间原生质体融合获得了再生植株,甚至可以实现体配细胞融合与再生[54--56].林木中的细胞融合主要集中于杨树等树种,且同其他植物一样,目前有关研究仍处72北京林业大学学报第25卷于实验室探讨阶段,存在许多有待解决的理论与技术难题,但其所展示的广阔应用潜力是毋庸置疑的.3展望我国粮食问题解决的成功经验表明,未来环境以及木材供应问题的解决,以林木育种为核心的林业科学技术的创新和突破将起到决定性的作用.而从林木育种的整体研究现状来看,仍处于较低利用层次的选种、引种和杂交等常规育种阶段,林木育种要像农作物育种那样有一个飞跃性的变化,使材积等方面的增益得以进一步提高,依赖于常规育种的潜力是有限的,期望有较大的突破已比较困难,除非采用新的育种方法.在被寄予厚望的基因工程育种技术尚难在现代林木育种中有所作为的今天,只有综合倍性优势和杂交优势的多倍体育种可堪重任.据Leran(1945,1948)的经验,最适宜染色体加倍改良的作物应该是:染色体数目少;以收获营养体为主;异花授粉.此后De wey(1979)又附加二点,即多年生习性和营养繁殖,并认为由此减少作物对种子生产的依赖性,对多倍体育种成功有重要的意义[4].显然,许多林木树种均符合上述条件,然而迄今培育成功并在生产中得到应用的林木多倍体却为数不多,究其原因,主要与树木细胞遗传等基础研究滞后、一些相关理论和技术难题未能得以攻克有关.在这样的理论与技术基础背景下,育种的结果大多是因技术问题而知难而退;有的虽然诱导成功,但由于获得的多倍体个体数量较少,不能通过大群体、强选择育种提高遗传增益而浅尝辄止.显而易见,林木多倍体育种技术潜力的发挥程度,与多倍体育种相关的细胞遗传学研究以及多倍体育种理论和方法的完善、创新及推广应用最为关键,有关问题也必将逐渐引起更多的关注.随着世界森林资源紧缺的加剧,林木多倍体新品种将以其速生、优质以及高抗逆性等特性,在森林工业用材(如纸浆材等)生产和生态环境建设中得到重视,而现代生命科学技术的进步也必将逐一解决相关的限制性难题,使林木多倍体育种焕发出新的生机与活力.可以预见,建立在现代遗传学以及细胞染色体工程技术基础之上的林木多倍体育种,将随着人类对其应用价值认识的提高以及有关新技术方法的注入而全面步入实用化程度,从而带动未来林业的持续、高效发展.参考文献1洪德元.植物细胞分类学.北京:科学出版社,19902Nilsson_Ehle H.Note re garding the gigas form of Po pulus tremula foundin nature.Here ditas,1936(21):372--3823Muntzing A.The chromosomes of a giant Populus t remula.He re ditas, 1936(21):383--3934W H路易斯主编.多倍体在植物和动物中的地位.鲍文奎译.贵阳:贵州人民出版社,19845蔡旭主编.植物遗传育种学.第2版.北京:科学出版社,19886J W赖特.森林遗传学.郭锡昌,胡承海译.北京:中国林业出版社,19817程金水主编.园林植物遗传育种学.北京:中国林业出版社,2000 8康向阳.毛白杨细胞遗传与三倍体选育.北京:中国环境科学出版社,20029J ohnss on H.Development of triploid and diploid Populus tremula 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生物多倍体诱导方法研究进展
生命科学研究２００７年１９１６年Ｗｉｎｋｅｒ［１］在研究Ｓａｌａｎｕｍ．ｎｉｇｕｍ嫁接时从愈伤组织得到了四倍体植物，首先引入了多倍体这一概念．多倍体植物在自然界中普遍存在，并被认为是推动植物进化的重要因素，是物种形成的途径之一．自然界中大约一半的被子植物，三分之二的禾本科植物，８０％的草类，１８％的豆类是多倍体．蓼科、景天科、蔷薇科、锦葵科、禾本科和鸢尾科中多倍体最多，许多农作物及果树、蔬菜是多倍体，如小麦、燕麦、棉花、马铃薯、花生、烟草、甘薯、苜蓿、山药、韭菜、荠菜、苦苣菜和香蕉等均为天然的多倍体．多倍体在动物中较为罕见，但也发现了一些多倍体动物，如鱼、青蛙、鸡、扁形虫、水蛭、海虾等［２］，另外哺乳动物中也鉴定出一只多倍体小鼠［３］．首先发现动物多倍体的是比利时生物学家凡・培内登在研究马蛔虫后提出的．随着大量分子生物学证据的积累，有关杂交多倍体动物物种形成的报道也越来越多［４］．Ｓｐｉｎｇ［５］提出了令人信服的证据，证明人和其他一些脊椎动物也许是一些古代多倍体，因为从醛缩酶到锌指转录因子等５０多个基因家簇，在无脊椎动物中是唯一的，而在人类不同染色体上可以达到４个等位点与之对应．另外医学上发现肿瘤细胞中也存在多倍体倾向，常被认为是由于细胞循环畸变的结果，但是也有人认为是细胞行为改变的原因．由于植物繁殖比较容易，如果自然形成的植物多倍体不能形成种子繁殖后代，还能依靠营养器官的繁殖产生后代，因而在生物进化过程中，植物多倍体被保留下来．而动物则不同，尤其是动物有性别分化后，大多数动物是雌雄异体，染色体稍有不平衡，就会造成联会紊乱，致使动物个体不能繁殖延续，而无性繁殖的个体，往往对环境的适应能力不强，在进化中难以形成稳定的种，因而在自然界中多收稿日期：２００７－０９－２７；修回日期：２００７－１１－２７作者简介：陶抵辉（１９６５－），男，湖南宁乡人，湖南农业大学博士研究生，湖南生物机电职业技术学院研究员，主要从事农作物育种研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｈｕｉｃｎ＠１２６．ｃｏｍ；刘明月（１９５７－），男，湖南蓝山县人，湖南农业大学教授，博士生导师．生物多倍体诱导方法研究进展陶抵辉１，２，刘明月１，肖君泽２，邓建平２（１．湖南农业大学园艺园林学院，中国湖南长沙４１０１２８；２．湖南生物机电职业技术学院，中国湖南长沙４１０１２７）摘要：从生物多倍体的意义、多倍体基因组的形成、多倍体的人工诱导等方面进行了综述，总结了多倍体诱变的物理、生物和化学方法现状，并对生物多倍体诱导中存在的几个问题进行了初步探讨．关键词：多倍体；诱导；离体培养；２ｎ配子；微管微丝抑制剂中图分类号：Ｑ－３文献标识码：Ａ文章编号：１００７－７８４７（２００７）Ｓ１－０００６－０８ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＩｎｄｕｃｔｉｏｎＭｅａｎｓｏｆＢｉｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄＴＡＯＤｉ－ｈｕｉ１，２，ＬＩＵＭｉｎｇ－ｙｕｅ２，ＸＩＡＯＪｕｎ－ｚｅ２，ＤＥＮＧＪｉａｎ－ｐｉｎｇ２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＬａｎｄｓｃｏｐｅ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２７，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｂｉｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｓａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙｇｅｎｏｍｅｓ，ｉｅ，ｍａｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗｅｒｅｐ．Ｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｐｈｙｓｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｗａｙｓｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓｔｈａｔｅｘｉｓｔｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓｔｕｄｙｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ；Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；ｉｎｖｉｔｒｏ；２ｎｇａｍｅｔｅｓ；ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅａｎｄｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２００７，１１（４）Ｓ１：００６～０１３）第１１卷第４期（专辑）生命科学研究Ｖｏｌ．１１Ｎｏ．４（ＳｐｅｃｉａｌＩｓｓｕｅ）２００７年１２月ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＤｅｃ．２００７第４期倍体动物少见．自从人类发现生物多倍体现象以来，各国科学家对此进行了深入研究，并在农业生产上产生了深远影响．如利用多倍体植物具有生物产量高、器官巨大性、无核不育性、速生性、营养成份或有效成份增加、抗病抗逆能力提高等特性，选育了大量多倍体农作物品种应用于农业生产，产生了巨大经济效益和社会效益，如三倍体西瓜、三倍体甜菜、三倍体毛白杨、异源多倍体小黑麦及花卉植物、中药材多倍体的应用．近２０年来，在多倍体水产动物研究上也取得了重大进展，已先后获得了草鱼、鲤、大西洋鲑、虹鳟等４０多种鱼类的三倍体及四倍体；扇贝、中国对虾、日本绒毛蟹等２０多种经济贝类和甲壳类的多倍体，以其生长快、产量高、性成熟晚、个体寿命延长、肉质好、风味佳、抗性强等优势在生产上得到应用，其中一些已进入了商品化生产，达到了产业化水平．多倍体技术在生产上发挥着越来越重要的作用，人们也越来越重视多方面研究和利用多倍体生物．１生物多倍体基因组的形成从目前的研究结果看，生物多倍体基因组主要起源于３种不同途径：即体细胞染色体加倍（ｓｏｍａｔｉｃｄｏｕｂｌｉｎｇ）、未减数配子的融合（ｕｎｉｏｎｏｆｕｎｒｅｄｕｃｅｄｇａｍｅｔｅｓ）和多精受精（ｐｏｌｙｓｐｅｒｍｙ）［６］．体细胞染色体加倍可以发生在普遍薄壁细胞、分生组织细胞、幼胚或合子中，普通薄壁细胞和分生组织体细胞加倍常常导致产生混合性的嵌合体，而合子或幼胚体细胞加倍则导致产生完全的多倍性孢子体．从细胞学机制上看，体细胞染色体加倍是形成多倍体基因组的途径之一，但对不同类群生物中体细胞加倍的自然发生频率、影响因素以及在物种形成和进化中的作用，目前还缺乏系统研究．在人工诱导植物多倍体的过程中，主要采用体细胞加倍方式进行．多精受精是指在受精时两个以上的精子同时进入卵细胞中，这种现象已在向日葵Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ等很多植物中观察到［７］．多精受精也是产生多倍体基因组的一条途径，但目前普遍认为这不是一条主要途径．自然界绝大多数多倍体是通过未减数（２ｎ）配子的融合而产生的．在减数分裂过程中染色体偶然不减数的现象在一些植物和动物中都已观察到，这可能是源自第一次分裂染色体不减数，也可能是由于第二次分裂只有核分裂而不进行细胞分裂，或者是在第一次分裂后即发生胞质分裂，并不再进行第二次分裂，从而导致产生二倍性的配子．不同生物可以通过不同的途径产生未减数的配子；不同生物的生物学特性不一样，未减数配子的发生频率也不一样．如在植物中行营养繁殖的多年生植物通常具有较高的末减数配子的发生频率，Ｒａｍ－ｓｅｙＳｃｈｅｍｓｋｅ［６］（１９９８）认为这可能是由于营养繁殖方式的存在，使其对有性生殖的选择压力有所松驰，从而为２ｎ配子或其他无功能配子的产生提供了一个宽松的环境，促进了２ｎ配子的形成，影响到多倍体的发生．在水产动物的多倍体人工诱导研究中，主要利用极体排放时的条件控制达到抑制第一极体或第二极体的排放，从而产生多倍体生物．在精卵结合后抑制卵母细胞第一极体的排放，则可生成三倍体，若抑制二倍体受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体．贝类多倍体诱导的机制在于抑制第一极体或第二极体的排放，因为贝类排放的卵只有受精后才能继续进行减数多裂，排出第一或第二极体．自然界中多倍体的产生无论是经历何种途径，其诱导因子往往是异常的环境条件，如异常温度（极端高、低温）、水分和养分胁迫、创伤、雷电、射线等均能诱导多倍体的产生，尤其在２ｎ配子形成中这种影响作用更显著．二倍体富利亚薯Ｓｏｌａｎｕｍｐｈｕｒｅｊａ在长期低温的状态下，产生不减数配子的频率高达９０％，而在温度有起伏或温暖的环境中只有５７％［８］，Ｇｒａｎｔ［９］发现生长在低营养环境中的Ｆ１代吉莉属植物Ｇｉｌｉａ，其每朵花产生多倍体的频率大约是生长在高营养环境中的９００倍．生物在它们的生境中经历了很多影响不减数配子产生的环境因素，这表明自然环境的改变和大的气候变化是本质上产生多倍体的动力．选择压力也是促进未减数配子形成的重要因素，由于恶劣的环境促进２ｎ配子的形成，因而也促进了多倍体的形成，同时由于染色体组增加，通常多倍体抗性好于二倍体，导致自然界很多多倍体多分布在高纬度、高海拔地带或其他极端环境中．多倍体的来源不外乎自然发生、人工合成和诱发突变等主要方式．自然发生的几率很低，也很不均衡．自从发现多倍体及其利用价值以来，各国科学家在人工定向诱变多倍体方面作了大量工作，取得了令人瞩目的成绩，在农业生产上产生了积极影响．陶抵辉等：生物多倍体诱导方法研究进展７生命科学研究２００７年２生物多倍体的人工诱导生物多倍体的人工诱导主要采用物理、化学和生物学方法进行．在成功的范例中，植物多倍体诱导以化学方法为主，物理、化学方法在水产动物多倍体诱导中采用较多，而生物学方法在动、植物中均有采用．２．１物理方法物理方法在水产动物多倍体诱导中主要有温度休克法、静水压法、电休克法及高盐高碱法．温度休克（包括高温和低温休克），其作用机制是温度的变化引起细胞内酶构型的改变，不利于酶促反应的进行，导致细胞分裂时形成纺垂体所需的ＡＴＰ的供应途径受阻，使已完成染色体加倍的细胞不能分裂，从而诱导多倍体的产生．该法主要注意对受精卵进行处理所应选择的时刻、处理持续时间和处理时的温度３个因素．洪一江等用冷休克法诱导三倍体兴国红鲤最佳条件为：人工受精后５￣８ｍｉｎ，将受精卵置于２℃的冷水中冷休克１０￣１５ｍｉｎ，再迅速回温至正常水温２０￣２５℃的水中，可获得７０±５％的三倍体胚胎，孵化率为５０％￣７０％．冷水性鱼类宜用热休克法，而温水性鱼类宜采用冷休克法．静水压法系利用专门的静水压设备产生的压力施加于处理对象，其作用机制是抑制纺缍体的微丝和微管的形成，阻止染色体的移动，从而抑制细胞的分裂，通过抑制第二极体的排放或第一次卵裂产生多倍体．该方法在水产动物中诱导率很高（９０％￣１００％），处理时间短（３￣５ｍｉｎ），且对受精卵损伤小，孵化率高．林琪等用静水压法诱导大黄鱼三倍体最佳条件为：水温２０￣２６℃受精２ｍｉｎ后，对受精卵施以４５０ｋｇ／ｃｍ２的静水压处理２ｍｉｎ，三倍体诱导率在６５．５％，孵化率达７０％．电休克法及高盐高碱法在水产动物多倍体诱导中近来才开始采用，由于研究及工艺不太成熟而未被广泛采用．电休克法采用直流或交流电对受精卵进行刺激，一般电压为１０Ｖ左右．高盐高碱法则是采用高ｐＨ或高盐诱导产生多倍体．另外，可利用人工雌核发育技术诱导四倍体，即运用辐射处理（主要是紫外线）或温度处理等方法使精子染色体失活，用失活的精子刺激卵进行雌核发育，并施以处理，阻止第一、二极体释放，达到诱变多倍体的目的．在植物多倍体诱导中，物理方式主要有温度激变、机械创伤、电离辐射（γ射线、ｘ射线）、非电离辐射（紫外线）、渗透压的改变、离心力、热冲击、超声波、干旱等环境胁迫、逆境处理等．２０世纪初，曾用切伤、嫁接、反复摘心法等使之形成加倍的不定芽，如早期用番茄打顶机械损伤产生四倍体．“切断———愈伤组织法”在葡萄和甘蔗等植物上诱导多倍体试验获得成功（华北农业大学等，１９７６）［１０］．俄罗斯玛什金娜（１９９０）利用温度变化诱导白杨及其杂种二倍体花粉率达９４．４％，用其与其它杨树正常雌花授粉杂交获得了８１．７％的三倍体杨树个体［１１］．李云等（２０００）采用极端温度处理毛新杨、银腺杨、银毛杨等雌花芽，均获得了苗期具有巨大性和速生优势的三倍体植株［１２］．第一个合成的双二倍体是一个染色体自然加倍的六倍体普通小麦×黑麦的杂种，就是通过热处理方式得来的．在１９３７年以前，瑞典植物学家曾用附有低温控制装置的“热刺激仪”使玉米受精后的合子发生染色体数目的加倍，以此获得了多倍体植株．辐射诱变常用的射线有电离射线（ｘ射线、γ射线、β射线、中子和α射线）和非电离射线（紫外线和质子）等．杨今后和杨新华（１９８４）利用照射剂量为５０００Ｒａｄ的γ射线辐照刚膨大或休眠的桑树冬芽，获得了四倍体植株［１３］．Ｃｏ射线处理萌动的杜仲种子可以产生多倍体［１４］．Ｓｍｉｔｈ－Ｍｋ［１５］抗枯萎病４号小种矮型香蕉品种进行γ射线诱导获得突变型四倍体．物理方法在植物多倍体诱导中系采用类似异常环境条件的处理方法，其诱变率低，定向性差，嵌合体严重，在一些具营养繁殖优势的植物上有应用，目前采用该方法诱导正逐步被淘汰．２．２生物学方法在水产动物多倍体诱导中，主要采用的生物学方法有远缘杂交、细胞融合、核移植等．远缘杂交在鱼类上应用较多．四倍体与二倍体贝类杂交生产三倍体贝类，三倍体率高达１００％，该方法简单，操作方便，避免了理化处理时环境因素的影响，能提高胚胎的孵化率和幼虫的存活率，适合于生产性养殖．利用四倍体与异种二倍体杂交可生产异源三倍体，目前，太平洋牡蛎四倍体与近江牡蛎二倍体杂交已获异源三倍体后代．鱼类中通过四倍体与二倍体杂交获得了三倍体虹鳟．细胞融合指通过对两个细胞施加一定处理，使其细胞融合，成为一个细胞，最终形成四倍性的胚胎，主要诱导囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或受精卵与受精卵之间的细胞融合，该项技术在淡水鱼及藻类育种方面有过尝８第４期试和应用，取得了一定进展．在细胞融合中，聚乙二醇（ＰＥＧ）为最常用、效果最好的融合剂，脂质体、激光和电融合也有一定的应用价值．姜卫国等［１６］用聚乙二醇诱导２个分裂球融合产生了一定比例的合浦珠贝母四倍体，特别是ＰＥＧ和ＣＢ（细胞松驰素Ｂ）共同处理能产生２０％以上的四倍体胚胎，但幼虫没有培育成功．Ｇｕｏ［１７］用ＰＥＧ对太平洋牡蛎进行处理诱导培育四倍体，分裂球间的融合产生了３０％的四倍体，并培育到了Ｄ型幼虫．细胞融合技术是建立在细胞和组织培养技术基础上的，随着动物细胞培养技术的不断研究和发展，该技术将在多倍体创造中发挥重要作用．核移植技术精细和难度大，通过核移植获得多倍体的方法还处于初始阶段．生物多倍体诱导法在植物领域主要采用有性杂交、胚乳培养、细胞融合（体细胞杂交）、组织培养等．有性多倍化比体细胞多倍化有更多的生物学特点，如更高的杂合性和更高的育性，且与多倍体自然形成的过程有相似之处，一是利用２ｎ配子，二是利用多倍体亲本．Ｎｉｌｓｓｏｎ－Ｅｈｌｅ（１９３８）最早用四倍体与二倍体杂交获得三倍体无籽西瓜，从而揭开了无籽西瓜应用于生产实践的序幕．Ｓｅｉｔｚ（１９５４）发现灰杨（Ｐ．ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）两性花上的一些花粉没有减数分裂，体型特大，经检测发现为二倍体花粉，用这些花粉对两性花上的雌花进行授粉，得到了大约１％的多倍体［１８］．２ｎ配子在自然界广泛存在，利用天然的或理化诱导的２ｎ配子与二倍体植株的１ｎ配子杂交获得三倍体，可以大大缩短育种年限，在一些行无性繁殖的果树、林木、马铃薯等应用研究上有积极意义．被子植物中的胚乳是双受精的产物，为一个精细胞与２个极核经双受精而来，具有双亲的遗传成份，为三倍体组织，对育种后代性状有一定预见性．通过胚乳培养的三倍体植物具有较高遗传稳定性，其果实是无籽的，胚乳培养目前已成为改良果树的重要途径．如柑桔［１９］（Ｃｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ）、苹果［２０］（Ｍａｌｕｓｐｕｍｉｌａ）、猕猴桃、西番莲等经胚乳培养均已获得三倍体植株．山茱萸、枸杞由于果核大、种子多带来加工困难，且降低产量和质量，我国已成功用枸杞胚乳诱发获得了染色体接近三倍体的植株［２１］．木本植物檀香、杜仲，果树中的红江橙、柚、杨桃等均已成功获得胚乳培养植株．细胞融合或称体细胞杂交或原生质融合，是采用人工方法把分离的不同属或种的原生质体诱导成为融合细胞，再经离体培养，诱导分化成为多倍体生物．其具体作法是用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞，得到大量无壁的原生质体，再经化学或物理方法诱导异核体，进一步融合后成为共核体，经培养后诱导分化出同源或异源多倍体植株．原生质融合是杂交在细胞水平上的发展，克服了植物远缘杂交障碍，是创造多倍体的新途径．１９６０年，Ｃｏｃｋｉｎｇ首次运用酶法去除植物细胞壁获得原生质体．Ｋ・Ｊ・Ｋａｓｈａ等对花粉进行核融合实验，得到了染色体加倍的大麦，这是多倍体育种在农业发展领域中的重大里程碑．Ｔｅｏｄｏｒｏｃａｒｄｉ等［２２］利用电融合技术将马铃薯和野生种的二倍体原生质体融合，得到了比亲本更有活性的再生植株．自１９８５年Ｏ－ｈｇａｗａｒａ等采用聚乙二醇诱导获得柑桔属与枳属间体细胞杂种以后，柑桔体细胞杂交取得了长足进展，通过原生质融合获得体细胞杂种和胞质杂种已经成为世界范围内柑桔品种改良的重要方法［２３］．随着化学融合、电融合、ＰＥＧ融合法技术的发展，已在近百种种内、种间和属间原生质体融合获得了再生植株．组织培养中的“体细胞无性系变异”是一种普遍现象，其中染色体倍性化变异是一个重要方面，在不添加任何诱变剂的情况下，可产生人工多倍体．向日葵瘤组织培养１６个月时，二倍体占优势，２８个月后，一半的组织为四倍体，其中一个组织系的八倍体细胞多至９６％．邓秀新等［２４］（１９８５）在柑桔愈伤组织培养基中加入１．５ｍｇ／ｋｇ的２，４－Ｄ处理后，多倍体细胞由对照的２．５％提高到２６．０％．Ｍｉｃｈａｅｌ等在未加任何诱变剂的情况下从西瓜的子叶培养中得到了频率较高的四倍体［２５］．马国斌等［２６］用西瓜和甜瓜的未成熟子叶、子叶和真叶作为外植体进行离体培养，诱导再生植株过程中发生染色体数目变异，获得了较高频率的四倍体变异．有报道石刁柏和胡萝卜的组织培养过程很容易产生四倍体．利用组织培养方法我国已获得了苹果、葡萄、芦笋、百合等园艺植物的多倍体材料．研究中发现染色体加倍效果与材料的发育阶段、取材部位、培养基类型、培养条件如光照、温度等密不可分，激素种类及其浓度对诱导也有一定作用．郭晓红［２６］等认为，激素及其累积效应对染色体产生了作用，但其机理有待进一步研究．２．３化学诱变采用化学诱变剂进行多倍体诱导是目前最常用、最普遍、最有效、最经济的方法，已经在生产上产生了积极作用，进入商业化和产业化领域．陶抵辉等：生物多倍体诱导方法研究进展９生命科学研究２００７年２．３．１化学诱导剂２．３．１．１秋水仙素（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）秋水仙素是一种被广泛应用的多倍体化学诱导剂，在动植物多倍体诱导中均有应用．它是从百合科秋水仙属秋种番红花秋水仙（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍａｎｔｕｍｎａｌｅ）的种子、球茎中提取出来的一种植物碱，一般为淡黄色粉末，纯品为极细的针状无色晶体，分子式Ｃ２２Ｈ２５ＮＯ６・１２Ｈ２Ｏ，熔点为１５５℃，易溶于冷水、酒精、绿仿，难溶于热水、乙醚等，对人体有剧毒，有麻痹作用，能使中枢神经系统麻醉而引起呼吸困难．秋水仙素一般有效诱导浓度为０．０００６％至１．６％，秋水仙素诱导生物体内染色体组加倍的机理与其细胞内微管、着丝粒的结构特性和功能表达密切相关，秋水仙素是生物细胞内与微管发生特异性作用的专一物质，适宜浓度的秋水仙素能有效破坏纺缍丝的形成而仍然保持细胞的活性，可以使分生细胞在复制时所加倍的同源杂色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍．在一定浓度范围内，秋水仙素对染色体结构无破坏作用，在遗传上很少造成其它不利变异，处理一定时间的细胞可在药剂去除后恢复正常分裂，形成染色体加倍的多倍体细胞．近年来随着植物组织培养技术的发展，结合多倍体诱导，经秋水仙素处理的器官或组织可被诱导产生不定芽而获得整倍体．刘庆忠等［２７］以苹果叶片为材料诱导不定芽，采用低浓度长时间处理，发现秋水仙素存在于叶片不定芽原基形成的全过程中，大大减少或排除了嵌合体形成的可能性．２．３．１．２除草剂一些除草剂在某些植物多倍体诱导中表现多倍化程度高、药害轻，值得引起重视和注意．如Ｃｈａｌａｋ［２８］用安磺灵（Ｏｒｙｚａｌｍ，一种二苯基胺类除草剂）获得了六倍体猕猴桃；戊炔草胺（Ｐｒｏｎａｍｉｄｅ，一种苯基酰胺除草剂）、甲基氨草磷（ＡＰＭ，一种磷酰胺除草剂Ａｍｉｐｒｏｐｈｏｓ－ｍｅｔｙｌ）和氟乐灵（Ｔｒｉｆｌｕ－ｒａｌｉｎ）在洋葱、甜菜、甘蓝胚培养中诱导多倍体已有成功报道．张兴平［２９］用抗微管形成的除草剂在西瓜染色体加倍上进行了试验研究，认为秋水仙碱并非最佳加倍诱导剂，实验表明用低浓度（１５￣３０μｍｏｌ／Ｌ）的重氮除草剂（如Ｏｒｙｚａｌｉｎ）可十分有效诱导西瓜染色体加倍，这类除草剂与纺缍丝蛋白的结合专一，对染色体损伤小，引起其他变异的机率比秋水仙碱小，并且在这些再生植株中不存在嵌合体和植株生长延迟现象．黄权军等［３０］用秋水仙碱、戊炔草胺、安磺灵、氟乐灵四种抗微管物质诱导毛新杨２ｎ花粉粒研究认为：秋水仙碱虽然能够诱导高比率的２ｎ花粉，但对被处理的植物材料产生了很大的毒害，大大降低了花粉产量，这三种抗微管的除草剂对植物微管蛋白有很强的结合力，对动物微管蛋白的结合力则较低，而秋水仙碱对植物微管蛋白的亲和性要低于对动物微管蛋白的亲和性［３１］，刚好和另外３种除草剂的性质相反，３种除草剂一般在μｍｏｌ／Ｌ浓度下就能诱导植物染色体加倍，而秋水仙素的浓度则需高出几十倍甚至上百倍，用以上除草剂更经济有效，对植物材料及人体毒性更小．ＡＰＭ是一种直接干扰植物微管合成的特异性药物，其作用类似秋水仙素，但ＡＰＭ更能专一性地抑制植物微管蛋白的聚合．２．３．１．３其他植物多倍体诱导剂自从１９３７年Ｂｌａｋｅｓｌｅｅ和Ａｖｅｒｙ发现秋水仙素具有多倍体诱导效果以来，已发现有２００余种化学试剂对植物多倍体有诱导作用，主要报道的有吲哚乙酸（ＩＡＡ）、萘骈乙烷、芫荽脑、８－羟基喹啉、对一二甲苯、２，４－Ｄ、萘嵌戊烷、氧化亚氮（Ｎ２Ｏ）、甲基黄酸乙酯、羟胺、吖啶、叠氮化合物、乙烯亚胺、萘乙烷、水合三氯乙醛、二氯代苯、甲苯磺硫苯胺基苯汞、甲基磺酸乙酯（Ｅｔｈｙｌｍｅｇｈｙｌｓｕｌ－ｆｏｎａｔｅ，ＥＭＳ）、鬼臼树脂、六氯化苯、三氯乙醛、氯化亚汞、Ｎ－亚硝基－Ｎ－二甲脲、哥罗仿、乙醚、亚硝胍（Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－Ｎｉｔｒｏ－Ｎ－Ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＭＮＮＧ），其它苯及其衍生物、有机砷制剂、有机汞制剂（富民隆、谷仁乐生、磷酸乙基汞）、磺胺剂、藜节碱及其它植物碱、麻醉剂、生长剂、激动素、抗生素等．这些诱导剂目前已较少使用．２．３．１．４诱导辅助剂在生物多倍体诱导过程中，二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、吐温、赤霉素、甘油、ＢＡ等作为辅助药剂，在提高染色体加倍效果上有一定的积极作用［３２］．有意思的是二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）无论在植物多倍体诱导中还是在水产动物多倍体诱导中均有辅助作用，在植物多倍体诱导中，ＤＭＳＯ添加浓度一般为２％￣４％，水产动物多倍体诱导中添加浓度为０．１％￣２％．二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）是运输化学物质进入组织的一种载体，在多倍体诱导过程中加入ＤＭＳＯ可作为一种助渗剂，能促进化学诱导剂快速进入生物细胞，从而缩短处理时间，减少毒害作用，提高处理效果，促进多倍化．谭德冠［３３］等采用１０。
实验三 植物多倍体细胞的诱发实验及其观察
三、材料
大蒜根尖（2n=16）：数目少，个体比较大，易 观察。
四、方法步骤
大蒜水培生根后，在0.05%秋水几次，分别进行酸解、酶解； 2-3人用一个根尖，用卡包品红染色5-10min； 盖上盖玻片，压片，镜检。
五、观察结果
观察染色体加倍情况，并绘图。
它能抑制分裂期纺锤体的形成而对染色体的结构和复制没有影响从而产生染色体数目加倍的核若染色体加倍的细胞继续分裂就形成多倍性的组织进而产生多倍性的植物
实验三 植物多倍体细胞的诱发实验及其观察
一、实验目的
了解多倍体的诱发原理及方法，掌握多倍体的鉴 定技术。
二、原理
植物多倍体是指每个细胞中的染色体数目具有三整套或更多套数的 植物。 多倍体普遍存在于植物界，目前已知道被子植物中有1/3或更多是 多倍体。 人工诱导多倍体的方法也很多，分为物理方法（温度剧变、机械损 伤、各种射线处理等）；化学方法（各种植物碱、麻醉剂、植物生 长激素等）。 秋水仙素是诱发植物多倍体的最有效方法之一。它能抑制分裂期纺 锤体的形成，而对染色体的结构和复制没有影响，从而产生染色体 数目加倍的核，若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组 织，进而产生多倍性的植物。
化学药剂诱导植物多倍体研究进展
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胺草磷 ,其处理浓度为 100μmol/L,在这种浓度下 ,每 100 个胚珠能诱导产生 417株二倍体植株 ,而用其它三种除草 剂处理 时 , 安 磺 灵 , 氟 乐 灵 和 戊 炔 草 胺 在 浓 度 分 别 为 1μmol/L, 10μmol/L和 10μmol/L 时 ,能使 100个胚珠分别 产生 218, 210和 210 株二倍体植株 。用甲基胺草磷处理 对胚发生产生的毒性相对较低 ,并且能使染色体加倍的比 率较高 ,在 100个植株中 ,能得到 89 个二倍体植株 ,而安 磺灵和氟乐灵对胚发生的毒害要严重的多 ,因此在用这 2 种药剂的处理中 ,染色体加倍植株得率要低得多 。戊炔草 胺虽然对被处理材料毒害不大 ,但它诱导染色体加倍的比 率并不高 。这 4种药剂和秋水仙碱相比 ,甲基胺草磷在诱 导饲用甜菜胚珠的染色体加倍时更加有效 ,并且其所用的 浓度比秋水仙碱浓度低了近 100倍左右 [ 15 - 16 ] 。
stadler等人在处理玉米的悬浮培养细胞时当秋水仙碱所用浓度为015能使约25的有丝分裂细胞停留在中期与之相比较他们发现甲基胺草磷比秋水仙碱更能有效的阻止悬浮培养细胞的有丝分裂当处理条件为浓度50mol处理时间2128h时也能产生约25的有丝分裂细胞停留在中期当把甲基胺草磷从培养基里移走以后被处理的材料能正常生长没有产生毒害作用而另一种除草剂氟乐灵在处理这种悬浮培养细胞时没有产生任何效果
植物多倍体的诱导
四、实验材料、器具及试剂
1.实验材料 洋葱（2n=16） 2.器具 显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、剪刀、 镊子、解剖针、小试管、刀片、载玻片、 盖片等 3.试剂 0.1%秋水仙素，0.5%的乙醇
五、实验步骤
1.培养材料 剪去洋葱的老根，置于清水中发根，然后转移到 0.1%秋水仙素中培养，一部分留在清水中，25℃培 养，直到根尖膨大并长长 2. 固定 用蒸馏水冲洗根尖2次,切取根尖末端0.5cm投入卡 诺氏固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)试管中,固定4~24h。 3.洗涤： 取出固定完毕的根尖先用50%的乙醇浸泡5min，用 蒸馏水浸洗2次，每次5~10min。 4.解离 先将1%盐酸放在试管中置60 ℃水浴锅中预热，然 后把洗涤干净的根尖转移至预热的试管中进行解离
植物多倍体的诱导及观察
一、实验目的 掌握植物多倍体人工诱导技术及多倍体鉴 定方法。了解人工诱发多倍体植物的原理、 方法及其在植物育种上的作用；观察多倍 体植物，鉴别植物染色体数目的变化及引 起植物其他器官的变异情况
二、实验原理
• 植物多倍体是指每个细胞中的染色体数具有3套或更多套 数的植物。随着染色体组倍数的增加，有可能使一些作物 的经济性状发生有利的变化。因此，植物多倍体的研究和 利用是育种工作中值得重视的途径之一。 • 人工诱导多倍体的方法很多，分为物理的（温度剧变、机 械损伤、各种射线处理等）和化学方法的（各种植物碱、 麻醉剂、植物生长激素等）诱导方法。其中，秋水仙素是 诱导多倍体的最有效的方法之一。秋水仙素是从百合科秋 水仙素属的一个种，秋水仙（Colchicum autumnale. L.）的 器官和种子内提炼出来的一种植物碱。它的化学分子式为 C22H25O6N。因有剧毒，故使用时要特别注意，切勿使药液 进入眼内或口中。 • 秋水仙素的作用在于阻止分裂细胞形成纺锤丝，而对染色 体的结构和复制无显著影响。若浓度适合，药物在细胞中 扩散后，不致发生严重的毒害，细胞经一定时期后仍可恢 复正常，继续分裂，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞， 并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。
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率和 变异率的影响。结 果表 明，０ ２ ． ％秋水仙素对种子进行浸泡 ，染 色体 未 出现加倍 ，而 ０ ３ ． ％秋 水仙素对子叶 进行连续 ７天的处理 ，诱导加倍情况最好。 关键词 ：悬铃木 ；秋水仙素 ；多倍 体
中图 分 类 号 ：Ｓ７ ２３ ９ ．７，Ｓ７ ２ ３ ５ ２ ． 文 献 标 识 码 ：Ａ
悬 铃木 多倍 体 诱导 的初 步 研 究 ‘
邓 传 良 秦 瑞 云 杨 金 华 张 准超 高 武军 赵 洁 卢 龙 斗
（ 河南师范大学生命 科学学院 ，新 乡 ４ ３ ０ ） ５ ０ ７
摘 要 ：采 用 顶 芽 滴 液 法 和种 子 浸 泡 法进 行 悬铃 木 多倍 体 诱 导 ， 比较 了不 同秋 水 仙 素 浓 度 和 不 同 处 理 时 间对 出 苗
２ 结 果 与分 析
２ １ 子叶诱导 结果 分析 ．
１ 枕料 与贲 法
１ １ 材 料 ． 二球 悬 铃 木 （ ｌｎａ ｕ ａｅｉ ｌ （ ｉ ） Ｐａ ｔｎ ｓ ｃ ｆ ｉ ｒｏ ａ Ａ ｔ ．
由表 １可见 ，秋 水 仙 素对 试 验 材 料有 损 害 作 用 ，随着浓度 的增加 ，损 害程 度加 重 。０ ２ ． ％浓 度
处理 死 亡 率 较 高 ，其 原 因 值 得 探 讨 。０ ３ ～ ．％
Ｗｉｄ 种子采 于河 南师 范 大学 校 园 ，采 回后 低 温 ｌ） ｌ 贮藏 。 １２ 多倍体诱变 方 法 ．
０６ ．％浓 度都 出现加倍 情况 ，但从 成 活率来 看 ，较 适宜诱 导处理 的为 ０ ３ 浓 度秋 水 仙 素处 理 ７天。 ．％ 图 １为染色体 未变 情况 ，其 染 色 体为 ４ ２条 。图 ２
参 考 文 献
［ ］ 范定臣，韩新华 ，骆玉平．绿 化树种悬铃木 的优势 、不足 １ 及 改进措施 ［ ］ Ｊ ．河南林业科技 ，１ ９ １ （ ） ４ — ４ ９ ， ９ ３ ： ３ ４． ９ ［ ］ 乔 士义，庞 品珍．悬铃木落 毛 问题 的研究 Ｉ ２ ．开花结实形 态发 育的初步观察 ［ ］ Ｊ ．南 京林学 院学报 ，１８ 。 （ ） ９５ ３：
・
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第 ５期
邓传 良等 ：悬铃木 多倍体诱导 的初 步研 究
５
３ 讨论 与结论
３ １ 试验表 明，不同处理方式的诱导结果不 同。 ． 用秋水仙素处理子叶可 以产生诱导效应 ，但是用 其 浸 泡 种 子 ，却 得 不 到诱 导 结 果 。 因此 ，较适 宜 的方式 是 用 ０ ３ ． ％浓度 的秋水 仙 素处 理子 叶 ７天 。 ３ ２ 本 文初 步研 究 了秋水 仙 素对 悬 铃木 诱 导 的结 ． 果 ，可以确定秋 水仙素 能使 悬铃 木染色体加倍 。 因而从理论上讲 ，通过秋水仙素处理获得悬铃木 四倍体是可行的，为悬铃木四倍体与二倍体杂交 ， 获 得无 球 三倍体 新 品种奠 定 了理论 基础 。
理为对照 。
浸种
先用温水 浸种 ２ ｈ ２ ，待萌发初露 白尖
时 ，用 ０２ 秋 水 仙 素 浸 种 ３ 、４ 、６ 、７ 、８ ．％ ６ ８ ０ ２ ４
和 ９ｈ ６ ，浸种结束后用清水洗净 置于育苗 盘中培 养 。以清水处理为对照。 】
河南省教育厅 自然科学基金项 目 （０ ７ ８０ ８ ，河南师范大学青年科学基金项 目 （ ０６ ３ ） ２０ １０ ２ ） ２ ００ ７
悬 铃 木 （ ｌｎ ｎｓａｅｆ ｌ ） 作 为 著 名 的行 Ｐａ ｔ ｕ ｃｒｏｉ ａ ｉ ａ 道 树有许 多优 良品质 ，但 其 种 毛 危 害 严 重 ，不 仅
１ ３ 多倍体 鉴定 方法 ． 根尖 染色体观 察 ，上 午 ８～１ ０点取材 ，置 Ｏ ℃
严 重污染环 境 ，对 人 的 身体 健 康 也 不 利 Ｊ 。为 了
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第３ 卷 ３
第５ 期
林
业
科
技
Ｖｏ． ３ Ｎ ５ １３ ｏ． Ｓ ｐ． ｅ ２００８
２０ ０８ 年 ９ 月
ＦＯＲＥＳＴＲＹ ＳＣｌ ＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨ Ｎｏ ＬＯＧ Ｙ
文章编号 ：１０ — ４ ９ （０ ８ ５— ０ ４— ２ ０ １ ９ ９ ２ ０ ）０ ０Ｏ ０
２ ２ 种 子诱 导结 果分 析 ．
［ ］ 赵蓬晖 ，张江涛 ，李艳 蕊 ，等．悬铃木 花粉染 色体加倍技 ４ 术研究．河南林业科技 ， ０ ６ ６ （ ） ４— ， ． ２ ０ ，２ ２ ： ５ ９ ［ ］ 孙 秀琴 ， 田树 霞． 四种 乔 灌 木 种 子 萌 发 特性 研 究 初 探 ５ ［］ Ｊ ．林业科技通讯 ，１９ ，（ ） ５— ６ ９ ０ ４ ：１ １ ． ［ ］ 韩 礼星 ，张海璇 ．猕猴桃 多倍 体诱 导研究 ［ ］ ６ Ｊ ．果树 科
冰水 中预 处 理 １ｈ左 右 ，卡 诺 固定 ２ｈ ｍ ｌＬ ８ ４ ，Ｉ ｏ／
盐 酸解离 ，卡宝 品红染色 ，常规 压 片法压 片 。
去除这种危害，以二球悬铃木为材料 ，探讨 了秋
水仙 素诱 导 悬铃 木 多 倍 体 的方 法 ，以期 能为 பைடு நூலகம் 育 无球悬 铃 木新品种 提供理 论基础 。
４ ５—４ ． ９
’
图 １ 二倍体体细胞 中期染 色体 （ ｎ＝ ２ ２ ４）
［ ］ 章 利 民．悬 铃 木 修 剪 控 果 技 术 ［ ］ ３ Ｊ ．江 苏 林 业 科 技 ，
图 ２ 四倍 体 体 细 胞 染 色体 加 倍 （ ｎ＝８ ） ２ ４ ２０ ０ ０，２ （ ） ７—３ ． ７ ３ ：３ ８
种 子 萌发
揉 搓 种子 去 掉 绒 毛 ，用 温 水 浸 种
为加倍情况 ，其染色体为 ８ 条。 ４
表 １ 秋水仙素对悬铃木 的诱导效应
至 自然 冷 却 ，大 约 ２ ｈ ２ 。捞 出后 用 变 温 ２ ℃ 晷／ ５
２ ℃夜 ，光照 ８ ０ ｈ处理 。 子 叶 处 理 待 种 子 长 出 两 片 子 叶 时 ，用 ０ ２ 、０ ３ 、０ ４ 、０ ５ 、０ ６ 五个 浓 度 的 ．％ ．％ ．％ ．％ ．％ 秋水仙素 溶液 处理 子 叶 。用滴 管将 秋 水 仙 素 滴 在 生长点处 ，每天 ２次 ，连 续 处 理 ７天 。 以清 水 处