蚯蚓提取物抗肿瘤作用的实验研究

蚯蚓提取物抗肿瘤作用的实验研究
何道伟;周菲
【摘要】目的:探讨蚯蚓提取物对Eca-109细胞生长抑制作用及机制.方法:应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析,流式细胞仪测定细胞凋亡,细胞周期及检测小鼠体内肿瘤质量.结果:蚯蚓提取物成分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中,只有大、中剂量(900,450 mg·L-1)成分Ⅱ对Eca-109细胞有明显的抑制作用,300,600 mg·L-1灌胃对小鼠肿瘤有明显的抑制作用.细胞检测有凋亡细胞出现,细胞被阻滞在G0-G1期,DNA合成受阻故使肿瘤细胞受抑制,肿瘤体积缩小.结论:蚯蚓提取物成分Ⅱ对肿瘤细胞增殖有明显的抑制作用,主要通过细胞凋亡和肿瘤细胞受阻于G0-G1期,使DNA合成减少.
【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》
【年(卷),期】2005(002)009
【总页数】3页(P225-226,230)
【关键词】蚯蚓提取物;肿瘤细胞;抑制率;凋亡
【作者】何道伟;周菲
【作者单位】东南大学医学院,江苏,南京,210009;南京市第三医院干部科,江苏,南京,210003
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
蚯蚓具有清热、定惊、平喘、利尿等功效。

近年来有报导[1～3]指出蚯蚓提取物具
有治疗恶性肿瘤的作用。

南京农业大学免疫生化研究所提取的3种成分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的化合物都无毒，我们观察了蚯蚓提取物的抗肿瘤活性，并对具有有效抗癌作用的成分Ⅱ进行了深入的比较分析研究。

1 材料与方法
1.1 材料
1) 蚯蚓提取物蚯蚓提取物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ由南京农业大学免疫生化研究所分离提取，用含小牛血清的RPMⅠ1640培养液稀释成所需的浓度，实验采用随用随配制。

2) 实验动物昆明种小鼠32只，体重18～22 g，雌雄各半，均由东南大学医学院动物中心提供。

3) 细胞培养条件 Eca-109肿瘤细胞系由中国科学院上海细胞研究所提供，培养在含10%的牛血清RPMI1640培养基中，贴壁细胞用0.25%胰酶消化传代。

悬浮细胞离心传代。

4) 仪器 SPECTRA核酸蛋白检测仪(MAX-250，波长570 nm)；TACSalibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 方法
1) 四甲基偶氮唑盐(MTT)显色实验在96孔培养板中加入浓度为225，450，900 mg·L-1蚯蚓提取物, 培养3 d，每孔加入5 g·L-1 MTT(Sigma公司产品)20 μl，继续培养4 h，轻吸去上清液，加入1 mol·L-1盐酸一异丙醇。

每孔的沉淀物用吸管用力吹打均匀，用核酸蛋白检测仪进行检测，计算细胞生长抑制率：
生长抑制率=(1-)×10%
2) 流式细胞仪检测将蚯蚓提取物Ⅱ 450，900 mg·L-1和对照组细胞培养24 h后用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，1000 r离心，加1% Tritam-X-100，37℃孵育，离心，加0.005% PI染色，用300目尾龙网过滤，15 min后上机检测。

3) 荷瘤小鼠的抑瘤实验取小鼠S180细胞系对数生长期细胞，用生理盐水配成一
定浓度接种于昆明鼠皮下(6.8×106/只 )共分4组，每组8只。

第2天灌胃，药物浓度为300 ，600，900 mg·L-1，对照组用生理盐水，连续灌胃15 d，第16天全部杀死小鼠，称瘤质量和小鼠体重。

表1 蚯蚓提取物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 对Eca-109细胞的抑制作用试品浓度/(mg·L-1)OD值抑制率/%Ⅰ9002 21±0 40-4501 87±0 35-2252 02±0 18-Ⅱ9000 33±0 0985 61∗4501 14±0 4749 65∗2251 53±0 50-Ⅲ9001 69±0 30-4501 51±0 26-2251 58±0 24-对照01 82±0 24-
注：与对照组比较，*P<0.01。

2 结果
2.1 蚯蚓提取物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ对Eca-109细胞抑制作用的比较
蚯蚓提取物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ对Eca-109细胞抑制作用的比较见表1。

从表1中可看出蚯蚓提取物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ中，只有成分Ⅱ具有明显的抑制作用，成份Ⅰ和Ⅲ抑瘤作用不明显。

2.2 蚯蚓提取物成分Ⅱ对Eca-109细胞增殖的影响
表2 蚯蚓提取物Ⅱ对Eca-109细胞的抑制作用药物浓度/(mg·L-1)OD值抑制率/%9000 33±0 1085 61∗6000 73±0 3467 72∗5250 90±0 4460 43∗4501
14±0 4749 65∗3751 42±0 391 8301 82±0 24-
注：与对照组比较，*P<0.01。

蚯蚓提取物成分Ⅱ对Eca-109细胞处理3 d后，对Eca-109细胞增殖的影响见表2。

由表2看出，高、中浓度的成分Ⅱ对癌细胞生长复制有不同程度的抑制，随着剂量的增加，OD值降低,有剂量依赖关系。

2.3 蚯蚓提取物成份Ⅱ对Eca-109细胞生长周期的影响
表3 蚯蚓提取物Ⅱ对肿瘤细胞细胞周期分布的影响肿瘤细胞组别各个细胞周期所占的百分比/%G0⁃G1期S期G2⁃M期Eca⁃109对照组68 9123 127 89高浓度
组76 7316 736 54低浓度组87 997 244 77
蚯蚓提取物成分Ⅱ对Eca-109细胞处理24 h对Eca-109细胞生长周期的影响见表3。

流式细胞仪检测结果表明，高(900 mg·L-1)、中浓度(450 mg·L-1)的蚯蚓提取物Ⅱ处理Eca-109细胞24 h后，细胞被阻断在G0-G1期，S合成期细胞大大降低，进入G2-M期细胞明显减少。

同时在检测细胞周期时，发现有明显的凋亡细胞产生，当浓度450 mg·L-1时有7.32%细胞发生凋亡，当浓度为900 mg·L-1时有15.9%的细胞发生凋亡，表明随着药物浓度升高，凋亡细胞比率随之升高。

表4 蚯蚓提取物成分Ⅱ对S180细胞的抑制组别药物溶度/(mg·L-1)瘤质量/g体重/g101 32±0 2820 04±2 3523001 04±0 1621 18±2 4136000 71±0 0923
06±1 9249000 69±0 1123 94±2 98
2.4 蚯蚓提取物成分Ⅱ体内抑瘤能力
蚯蚓提取物成分Ⅱ体内抑瘤能力见表4。

从表4可看出，随着药物浓度的增加，小鼠体重增加，瘤重降低，表明蚯蚓提取物成分Ⅱ在体内有明显的抑瘤作用。

3 讨论
肿瘤实际上是细胞增殖失控，分化丧失或细胞异常[4]，抑制增殖循环是目前治疗肿瘤，减少其转移和复发的方向之一。

本研究表明，蚯蚓提取物Ⅱ能使Eca-109肿瘤细胞阻滞在G0-G1期，进入S期的DNA减少，相应进入G2-M期细胞数量减少，DNA合成总量也随之减少，肿瘤细胞增殖受阻。

体内外实验均表明，蚯蚓提取物Ⅱ具有一定的抗肿瘤作用，且以高、中浓度较明显，具有一定的剂量效应。

同时，本研究证实，蚯蚓提取物Ⅱ能促进Eca-109细胞发生凋亡，随着药物浓度升高，凋亡细胞比率随之升高。

已有研究表明，多种抗癌药物可引起癌细胞凋亡，抗癌药效果与诱导癌细胞凋亡能力相关[5,6]。

总之，蚯蚓提取物Ⅱ具有一定的抗肿瘤作用，其机制可能是通过细胞阻滞在G0-G1期，使细胞进入S合成期减少，或是通过细胞凋亡，抑或是通过阻断肿瘤内血
管的生成或其它方式，尚有待进一步研究。

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