免疫分型教程

40-免疫分型教程(1) 正常骨髓免疫分型
上图是正常骨髓经CD45、CD71、CD33染色后组成的CD45/SSC、CD71/CD33双参数散点图；通过这两个组合，能够分辨骨髓的正常细胞、检查是否有异常细胞存在、评估细胞的成熟情况。

CD45/SSC图中可见：
1，CD45强阳性SSC低信号的细胞群为淋巴细胞（褐色细胞群体）；
2，中等强度的CD45表达，SSC信号最强的细胞群体为粒细胞（蓝色及红色细胞群体）；3，CD45表达与SSC信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体（绿色细胞群体）；4，CD45阴性，SSC信号最低的有核红细胞和细胞碎片；
CD33/CD71图中可见：
1，CD33表达最强的单核细胞群体（绿色）；
2，粒细胞CD33表达较单核弱，不成熟粒表达CD71，成熟后不表达。

3，淋巴细胞、有核细胞和细胞碎片不表达CD33、CD71。

CD11B/CD15图可用来评估髓系细胞向单核、粒分化的程度（随着髓细胞成熟，细胞逐步获得CD11B，粒细胞高表达CD15）：
1，单核细胞（绿色）高表达CD11B，CD15中等到表达；
2，粒细胞（蓝色及橘红色）高表达CD15，蓝色成熟粒CD11B表达较橘红色不成熟粒细胞强，幼稚髓细胞仅表达CD15而无CD11B。

3，T、B淋巴细胞不表达CD15、CD11B，NK细胞表达CD11B而无CD15（红色细胞）。

4，有核红细胞及碎片不表达CD15和CD11B。

根据骨髓细胞CD45/SSC图中分布情况设门圈定各类细胞：
R1门为成熟淋巴细胞；
R2门为正常单核细胞位置；
R3门正常粒细胞位置；
R4门为幼稚淋巴细胞出现位置；
R5门为有核红细胞或细胞碎片位置；
R6门为幼稚髓细胞出现位置；
白血病细胞通常会在R4、R6两门位置处出现。

M0免疫分型
M0:急性髓细胞白血病微分化型原始细胞在光镜下类似L2型细胞,核仁明显,胞浆透明,嗜碱性,无嗜天青颗粒及Auer小体,髓过氧化酶(MPO)及苏丹黑B阳性细胞<3%;电镜下,MPO(+);CD33或CD13等髓系标志可呈(+),淋巴系抗原通常为(-),但有时CD7+,TdT+;部分急非淋白血病可表现CD7+,TdT。

形态学：幼稚细胞占骨髓有核细胞90%以上；肿瘤细胞不出现AUER小体；粒细胞缺少，MPO或苏单黑染色阴性。

遗传学：染色体常有复杂的异常，特别是5和7号染色体。

当病例伴T（9；22）时会出现淋系抗原。

幼稚细胞群体的FS和SS信号低，在CD45/SS点图中特征性地与幼稚淋巴细胞区域相连。

幼稚细胞至少表达一种骨髓抗原：CD13，CD33，但完全缺乏髓系成熟分化抗原：CD11B，CD15和CD16。

相当一部分病例TDT 阳性，但在肿瘤细胞上分布不均。

肿瘤细胞通常淋系抗原阴性，但有时也会表达CD7或CD4；HLA-DR通常阳性，CD34则为阴性。

有学者指出伴CD7和CD34同时表达的病人预后不佳。

检测胞浆内MPO比CD33/CD13联合检测更为敏感。

M0中MPO阳性率一般小于3%，如大于3%则要判定为M1。

M0:HLA-DR+,CD34+,CD13+/-,MPO+,CD14-,CD11b-,TdT-/+to+/-
骨髓样本类似纯化的培养细胞，在CD45/SSC图中可见到数量占绝大多数的一群幼稚细胞群体。

这群异常细胞在的SSC信号较低，大小中等。

幼稚细胞CD19、CD34阴性，但同时表达CD13和CD33。

CD13表达稍弱，且抗原表达较CD33不均一。

白血病细胞占了所有细胞群体的96%。

HLA-DR在这些髓系细胞上不表达。

这些幼稚细胞表型的情况是：CD13阳性，CD33阳性，CD34阴性，HLA-DR阴性。

这个表型与AML-M3相以。

肿瘤细胞不表达CD71、CD117、CD18、CD11b和CD15。

CD64是阴性，但CD14表达。

CD14表达强度比较弱与CD13相似。

T细胞标志物CD2、CD5、CD3和CD7都不表达。

在图中可观察到残存的一些T细胞。

与阴性对照相比，CD4弱阳性表达。

诊断：AML微分化型，CD34和HLA-DR阴性。

实验室进一步诊断：MPO（免疫组化）阳性，NSE阴性，46XY，t(3;5)(q25;q34)
重要说明：
本例中白血病细胞免型表型为：CD34-、HLA-DR-，CD13+，CD33++，表面看与AML-M3相似。

在许多幼稚细胞胞浆内存在的颗粒会导致AML-M3的误诊。

但FCM的数据提供了一些有价值的信息避免这个错误。

具体总结如下：
（1）表达CD14（克隆号leu-M3），尽管表达有所降低；（2）SSC信号降低并且相对分散。

这一点十分重要，因为AML-M3v的SSC信号比较集中，甚至M3v细胞中带有颗粒。

另一重要信息是CD13表达下降甚至缺失而CD33强阳性（一种异常的CD13/CD33表达模式）。

有时AML-M3可能会缺失表达CD13。

对于这些疑难病例需要借助分子遗传学和细胞遗传学诊断工具来建立正确的诊断。

其他标记物如：B cells (CD19, CD20, Kappa, Lambda), CD10(Calla), CD5 (T cells), CD41 (platelet)都是阴性。

光散射图中显示在前向散射光和表示颗粒度的侧向散射光有一群处于中间位置的细胞。

这与组织学检测结果相一致。

（暂无图）
将光散射图中的异常细胞放置于CD45/CD14上显示发现CD45阳性并CD14阴性（99%）。

CD45表达强度低于成熟淋巴细胞，可能是由髓系细胞和未成熟幼稚细胞组成。

（暂无图）
在HLADR/CD3等高图中发现其中大部分DR阳性（81%）并且CD3阴性（T细胞受体）。

这个表型可见于活化的T细胞和成熟B细胞（CD45强阳性）。

DR表达于绝大多数髓系细胞、B细胞和活化的T细胞。

CD34/CD38图中显示细胞CD34阴性并且CD38阳性。

CD38可见到浆细胞、前B细胞、单核细胞、ALL细胞和绝大多数AML细胞。

此处可排队浆细胞的可能性（CD45阴性），前B细胞还无法排除，单核细胞可排除（CD14阴性）。

CD13/CD15等高图中显示大部分细胞（63%）髓系抗原CD13/CD15阴性。

但此处提供了一丝线索，因为有些细胞（30%）表达低水平CD15。

绝大部分AML M1-M6细胞同时表达CD13和CD15。

从CD33/TdT图中可以肯定这些细胞源自髓系（CD33阳性）。

无细胞表达TdT。

这表明这些细胞是处于极早期的髓系细胞，可能AML-M0/M1。

CD11b/GPA双参数图中也证实了这些细胞早期髓系的属性。

GPA在这些细胞上弱表达。

这种情况可见于早期髓系干细胞。

CD11b可见于单核细胞、粒细胞，NK细胞不表达此抗原。

这些细胞还同时表达CD7。

这使人感觉有误，但现已知早期髓系白血病细胞可偶然同时表达CD7。

将这些结果综合来看支持M0或M1的诊断。

要用流式细胞仪来区分M0和M1现还有困难。

所以还要结合组织学检测的结论，如发现有MPO阳性则支持M1，如阴性则为M0。

M1免疫分型
幼稚细胞成群，RALS信号弱。

M1与M0很难区分，但M1 细胞大小及颗粒度较M0稍大，与原粒细胞接近。

至少伴随一种髓系抗原：CD13或CD33。

高表达HLA-DR，CD34阳性但较M0弱,>3%的幼稚细胞表达MPO，较M0多。

不表达CD11B，CD15，CD16等。

M1:CD11B-/+,HLA-DR+,CD13+,CD33+,CD34+,CD14+,MPO+,TdT-/+to+/-
M2免疫分型
CD45/RALS图中细胞分布广泛与M1不同，这是因为M2细胞已进一步分化幼稚细胞减少，粒细胞增多并与BLAST WINDOWS区域内细胞相连。

因细胞没有明显分群，很难将异常细胞与正常相区分，故设立多个门进行分析检测其成熟度抗原的表达情况。

M2免疫表型与M1类似，HLA-DR，CD33，CD13阳性。

上图中可见幼稚细胞CD33与CD71表达均比成熟粒细胞强。

CD13表达强于CD33。

M2肿瘤细胞弱表达CD15与CD11B,说明细胞已分化。

CD34表达显著降低。

M2肿瘤细胞不表达CD5,CD7和TdT等抗原，如病例伴t(8;21),则经常表达CD19偶表达CD56。

一般肿瘤细胞MPO强阳性。

偶见形态为M2并伴t(8;21)，但CD13-，CD33-，CD14-，而MPO+。

细胞分布广泛，幼稚细胞较M1少。

CD13和CD33阳性，且CD13表达高于CD33。

HLA-DR阳性，CD15弱阳性。

M2肿瘤细胞伴t（8，21）CD19阳性。

M3免疫分型
上图为M3V，少颗粒型早幼粒白血病细胞，细胞中颗粒少RALS信号低而集中，SS座标上出现大量肿瘤细胞。

肿瘤细胞大，FS信号强。

通过CD45/RALS双参图可辨别出M3与M3V。

下为经典M3多颗粒细胞的CD45/RALS和SS/FS图。

M3与M3V在免疫表型上无区别。

M3肿瘤细胞特征性地不表达髓系早期标志物CD34和HLA-DR；部分病例中CD9特征性地阳性，但不是完全特异。

CD2在M3与M3V中会出阳性表达，在HLA-DR阴性的病例中，与染色体t(15,17)异常相关。

肿瘤细胞CD33表达比正常粒细胞强与正常单核细胞相似， CD13表达多样。

肿瘤细胞不表达晚期髓细胞分化抗原CD15， CD16和CD11B。

肿瘤细胞完全不表达CD15，与正常早幼粒细胞表达CD15相区别；正常早幼粒细胞细胞周期中含高比例S期细胞，而肿瘤细胞中几乎不见细胞周期。

肿瘤细胞MPO阳性，上图中MPO与LACTOFERIN双染来区分成熟粒细胞。

肿瘤细胞除表达CD2外，很少表达T或B系抗原。

M3肿瘤细胞因其胞浆内多颗粒，细胞具有很强的自发荧光。

M3:CD33+,CD13+,MPO+,CD34-,HLA-DR-,CD11b-, CD14-,CD15-,TdT-
M4免疫分型
典型的M4病例CD45/RALS图中会出现一群异常的单核细胞和一群骨髓幼稚细胞，肿瘤细胞较M0，M1细胞的FS和SS信号增强。

有时这两群细胞会相互叠加占据BLAST WINDOWS和成熟单核细胞位置，故难圈出独立成群的肿瘤细胞。

对于M4病例一般都设多个门对异常细胞进行分析，且每个异常细胞群根据其成熟度的不同，表型也可能互不相同。

本例为M4EO，增多的嗜酸细胞RALS信号与早幼粒相似CD45信号与单核细胞相似，本例中为R4
门中紫色细胞。

幼稚细胞群表达CD34，HLA-DR，而异常单核细胞则CD34阴性，HLA-DR阳性。

幼稚细胞CD33阳性，CD14阴性，而异常单核细胞则为CD33阳性，CD14，CD64阳性。

CD64表达如象本图中强阳性表达则为单核细胞特异性标志。

M4肿瘤细胞在CD11B/CD15图中会特征性分布如上，存在幼稚细胞及各期的粒细胞及单核细胞。

CD2表达与M4EO有很大相关性，可能与16号染色体异常有关。

M4/blast population: CD13+,CD33+,CD34+,HLADR+,CD11b-,CD14-
M4/abnomal monocytic cell:CD13+,CD33+,CD34-,HLA-DR+,CD11b+,CD14+/-,CD4+/-
M5免疫分型
M5肿瘤细胞从细胞大小、颗粒度和CD45表达都向成熟单核细胞过渡，形成一大细胞群体。

M5分为二个亚型M5a和M5b，前者细胞稍大，与成熟单相比CD45表达弱但不独立成群。

髓系细胞的分化情况可从CD15/CD11B双参数图中观察,本例中肿瘤细胞CD15较平常高,但低于右上角黑色的粒细胞.不成熟的
单核细胞CD11B表达弱.如出现CD33阳性，CD13，CD34阴性。

M5肿瘤细胞通常高表达CD33，CD13表达多样。

CD4是髓系幼稚细胞向单核系分化的敏感指标。

CD14一般表达在成熟单核细胞上，本例中肿瘤细胞CD14阴性，CD64阳性。

AMML 病例中，CD64在单核细胞上表达特别强。

本例中CD61弱阳性,这种情况是由于幼稚细胞与血小板粘附造成的。

M5a: HLA-DR+,CD11b+/-,CD34+,CD33+,CD13+,CD14-/+,CD4+/- M5b: HLA-DR+,CD11b+,CD34-,CD13+,CD16+/-,CD14+,CD4+/-
M6免疫分型
本例中可见两群幼稚细胞，M6的定义是红系祖细胞占骨髓幼稚细胞群体的50%强，而其他系别的幼稚细胞可占30%以上。

固诊断M6时要依据形态学红系细胞的数量来确定，如仅根据免疫分型很难得出正确诊断，必须结合形态计数幼稚细胞数量来确定。

以上是典型的M6免疫分型图，出现两群幼稚细胞。

肿瘤细胞可通过CD71强阳性表达加以确认，在一些红细胞稍成熟病例中血型糖白A阳性。

HLA-DR，CD34和CD33或CD13通常阳性。

很多M6病例中会出现一群髓系幼稚细胞，如本例中的红色细胞群体。

M6;CD71+,GP-A+,CD34+/-,HLA-DR+/-,CD13+/-,CD33+/-,CD34+/-,CD14-,CD11b-
M7免疫分型
本例中幼稚细胞CD45/RALS信号都不强。

与B-ALL，M6的肿瘤细胞相似。

M7肿瘤细胞表达CD61和CD41，髓系抗原表达多样。

成熟血小板粘附地白细胞也会表达CD41和CD61，这时会对诊断产生影响，此时要加做CD62来确认是否为成熟血小板粘附造成CD41或CD61阳性。

本例CD34阳性，CD71弱阳，其他系别抗原不表达。

其他系别抗原均为阴性，与M0、M1相似。

M7:HLA-DR+,CD34+,CD33+/-,CD14-,MPO-,TdT-
TALL 免疫分型
T-ALL的肿瘤细胞CD45表达较B-ALL细胞强，肿瘤细胞在CD45/SSC图中可能会出现在BLAST WINDOWS或单核细胞区或与正常淋巴细场胞相混。

本例中肿瘤细胞CD10阳性，约三分之一的T-ALL会出现该现象，但CD19绝对阴性。

本例CD34阳性，约40%的T-ALL的肿瘤细胞CD34阳性，与细胞是否表达原始或成熟表型无关。

T-ALL肿瘤细胞表面CD3经常阴性,但如用PE标记的CD3抗体则经常能检测到弱阳性。

CD3/CD5双参数图中，肿瘤细胞总出现在正常T细胞以外的位置上,上图中黑色阳性颗粒为正常T细胞.肿瘤细胞CD4/CD8表达多样化,但是总与正常T细胞的表达不两只,如发现CD4/CD8双阳性则提示为T-ALL。

T-ALL最敏感的指标是CD7,但其特异不强有近30%的AML同样阳性。

当CD7与HLA-DR联用时其特异性增强，许多T-ALL，特别是在儿童，CD7强阳性而不表达HLA-DR，而在AML中CD7弱表达并伴HLA-DR阳性。

T-ALL因与T细胞的成熟度相关，可被分为三期：
pre-thymic：CD7+，CD1a-，CD4/8-，CD3-；
thymic:CD7+，CD4/8+，CD3-；
matrue:CD3+,CD1a-;
原始T细胞ALL与AML很难区分，要加测胞浆内CD3。

T-ALL最常见的表型是：CD2，CD5，CD7，CD1，CD4/8双阳性，CD3弱阳性，TdT 强阳性。

次其次为：CD2，CD5，CD7 和TdT强阳性。

再次为：CD2，CD5，CD7伴CD4或CD8部分表达，CD3表达少并少量表达TdT。

T-ALL的共同特征是：下调表达T系抗原或出现异常抗原的联合表达。

B ALL免疫分型
急性B淋巴细胞性白血病可大致分为早前B-ALL，前B-ALL和成熟B-ALL，区分他们的依据是免疫球蛋白的表达及其表达位置。

具体情况如下：
1,成熟B细胞ALL表达表面免疫球蛋白（sIg）
2,前B细胞ALL细胞胞浆内表达免疫球蛋白重键(cu)而不表达轻链
3,早前B-ALL则两者都阴性
然而上述情况在用于诊断B淋巴细胞性白血病时常出现混淆。

因为胞浆内免疫球蛋白重链cu在诊断过程中很少被检测，从而那些表面Ig阴性的病例全都被归于前B-ALL。

早前B细胞型（B-precursor or early pre-B）占儿童急淋的65%左右，占成人的50%左右。

白血病细胞，根据形态对应FAB的L1或L2型，处于B细胞成长的最原始阶断。

细胞小而无颗粒，流式细胞分析期细胞的前向和侧向光信号很弱；特异性地，其细胞表面或胞浆内不表达免疫球蛋白。

白血病细胞通常至少部分地表达干祖细胞抗原CD34和不成熟淋巴细胞抗原HLA-DR或TdT。

另外，少数罕见病例会同时表达CD10
和B细胞相关抗原CD19。

其他在早前B细胞型白血病细胞上表达的 B细胞抗原有CD9，CD22和CD24；这些抗原通常在B细胞成熟的中晚期才表达。

CD20也是一具有广泛意义的抗原，但它的表达变异很大，会经常出现CD20阴性的细胞；这种混合型表达CD20与以CD20集中地、高表达的成熟B细胞有很大的区别。

早前B白血病细胞的免疫表型与正常原B细胞很相似，但白血病细胞抗原的异常表达常会出现：同时异常地表达早期和成熟抗原，异常地抗原交叉表达（特别为髓系抗原），或最常见的为抗原表达的强度变化。

在儿童ALL中，早前B细胞白血病的免疫分型与疾病预后有很大的相关性，除CD10阴性的肿瘤特别是婴儿，其预后一般较好。

婴儿CD10阴性的白血病事实上经常会出现染色体11q23异常,从而导致MLL基因重排，预后差。

其他"11q23异常的白血病"可出现的免疫表型包括表达髓系抗原CD15并失去抗原CD24。

白血病细胞通常会表达CD34和其他一些髓系抗原，但表达情况多变。

除表达髓系抗原外，细胞还会强表达B系抗原CD19。

其他一些预后比较差的如t(9;22)并由此而形成BCR-ABL融合基因病例，这种情况多见于成人ALL，而儿童相对少见，由引可解释为什么成人ALL的预后较儿童的差。

Ph1染色体阳性的病例经常会表达髓系抗原，这与CD34、CD10、CD19和CD25表达有重要关系，但目前尚无相关性的统计数据来定义此亚型。

一些儿童早前B细胞白血病预后特别好，除上述病例中超二倍体肿瘤以外，那些伴t(12;21)(p21;q22)的病例预后也较好。

这些易位产生了融合基因TEL/AML1，并主要见于种早前B细胞白血病，并且好发于1-10岁的儿童。

流式免疫分型发现，这些病例特异地强表达CD19，CD10和HLA-DR，并会出现双峰表达CD34，部分细胞表达或失去CD9，部分细胞弱表达CD20。

CD66c（KORSA-3544）一致地不表达。

CD10高表达伴CD9和CD20弱表达与TEL/AML1融合基因的产生有紧密关系。

B-precursor-ALL的肿瘤细胞FS/SS信号弱，CD45表达也不强，
有些病例的肿瘤细胞在CD45/SSC图中与有核红细胞位置相当。

B-precursor-ALL对应于FAB分型的L1和L2型。

B-precursor-ALL的肿瘤细胞CD10/CD19强阳性，CD33弱阳性如使
用PE标记的CD33抗体检测阳性增强但不可据此判定为混合型白血病。

通常根据CD10表达与否可将B-precursor-ALL分为两亚型：
CD10+和CD10-，CD10+的病人预后较好
B-precursor-ALL与B-cell-ALL的区别在于肿瘤细胞表面是否表达免疫球蛋白轻链。

PRE-B-ALL胞浆重链阳性而表面免疫球蛋白轻链阴性。

如同CD19，HLA-DR在B-ALL中也广泛表达，但它没有特异性。

其他有用的指标有CD22和CD20，前者几乎与CD19有相同的特异性而后者弱。

CD24在许多B-ALL中表达，但它在一些AML也表达。

在B-ALL中常见表达但没有系别特异的抗原有CD10和CD34。

CD34阳性在B-precursor-ALL中常见，而在Pre-B或B-ALL则通常为阴性。

前B细胞性ALL，被定义为胞浆内u重链阳性，细胞处于B细胞成熟的后期阶段。

前B细胞ALL大概占儿童ALL的25%，在成人ALL中的比例很低。

与这一亚型相关的是t(1;19)并产生E2A/PBX1融合基因，并因此而发生耐药，预后较差。

前B 细胞白血病大概有25%的病例有t(1;19)异位，但在原B细胞白血病中少见。

ALL伴t(1;19)强表达CD19，CD10和CD9并CD34阴性，而CD20经常缺失或弱表达，这样就形成了一个很特异的免疫表型。

大概60%表现以上表型的病例经分子生物学检查发现E2A/PBX1融合产物。

而在其他免疫表型中未见此基因重排。

流式细胞分析可成为分子生物学分析的重要初筛工具。

成熟B细胞性白血病占全部ALL的2%-5%并包含Burkitt‘s淋巴瘤性白血病。

在形态学上其对应FAB的L3型，具有比幼稚的B系原始细胞高的光散射信号。

它们同时具有较强的CD45表达，从而这些细胞在CD45 vs RALS双参数图中位置接近于更成熟的淋巴细胞和单核细胞。

成熟B白血病细胞其胞浆膜上强表达Ig。

并表现为一致的CD19，CD20，CD22和CD24高表达，但CD34和TdT为阴性。

许多病例CD10可阳性，但因其同时表达成熟抗原和sIg可用来把成熟B细胞ALL与其他不成熟B细胞ALL 区分开来。