暗纹东方鲀致病性维氏气单胞菌的分离鉴定

暗纹东方鲀致病性维氏气单胞菌的分离鉴定
常燕;王兆慧;刘思园;徐磊;曹军
【摘要】A bacteria strain was isolated from the obscure puffer (Takifugu obscurus),morphology,physiology and biochemistry,16 S rDNA polymerase chain reaction (PCR) amplification and artificially infection of health obscure puffer and ICR mice were determined.The results showed that the medianlethal dose of this bacteria to mice and obscure puffer were
2.26×106 and 5.96×104 CFU/mL,respectively.The 16 S rDNA sequence showed high similarity with Aeromonas veronii,plus the morphological,physiology and biochemistry data,this strian was determined as A.veronii,and named as NT-HV.Then,the sensitivity of this strian was tested using nine common aquatic drugs.The results showed that NT-HV was sensitive to florfenicol,trimethoprim-sulfamethoxazole,neomycin,oxygen piperacilliny,and resisted to tetracyclics,doxycycline,carbenicillin,ampicillin,suggestting the reasonable drug concentration and alternative using was necessary.%从濒死的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)体内分离到一株优势菌株,经形态观察、生化、16 S rDNA 聚合酶链式反应(PCR)以及人工感染健康暗纹东方鲀和ICR小鼠等试验可知,该菌对小鼠和暗纹东方鲀半数致死量(LD卯)分别为2.26×106 CFU/mL、5.96×104 CFU/mL;其16 S rDNA序列与维氏气单胞菌具有高度的同源性,根据该菌的形态特征、生理生化特性,初步鉴定该菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),命名为NT-HV.选择9种水产常用药物进行药敏试验,结果显示该菌对氟苯尼考、复方新诺
明、新霉素、氧哌嗪青霉素敏感,对养殖场常用的四环素、强力霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素不敏感,提示在药物的使用过程中应注意药物的浓度和合理轮换.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2013(052)003
【总页数】4页(P629-632)
【关键词】暗纹东方鲀(Takifugu obscurus);维氏气单胞菌(Aeromonas veronii);致病性;分离;鉴定
【作者】常燕;王兆慧;刘思园;徐磊;曹军
【作者单位】南通大学生命科学学院,江苏南通226019;南通大学生命科学学院,江
苏南通226019;南通大学生命科学学院,江苏南通226019;南通大学生命科学学院,
江苏南通226019;南通大学生命科学学院,江苏南通226019
【正文语种】中文
【中图分类】S941.42
2010年10月，江苏某特种水产养殖场养殖的暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）发生死亡。

病鱼主要表现为腹部极度膨大，肛门红肿，体表及胸鳍、腹鳍和臀鳍残缺，鳍条基部充血、出血。

解剖发现腹腔内有大量淡黄色带血的腹水流出；肝脏肿大，呈土黄色，有大小不一的出血斑块；胆囊膨大；肠道无食，充满泡沫状黏液，肠黏膜出血。

取症状典型的濒死暗纹东方鲀心脏、肝脏病灶进行细菌分离培养，获得一株优势菌株。

本研究通过对分离菌进行形态观察、生理生化试验、16 S rDNA序列分析，初步鉴定该菌为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii），命名为
NT－HV，同时对其毒力及药物敏感性进行试验，旨在分析该菌的分类地位、致病因素、筛选敏感药物，为有效防治暗纹东方鲀维氏气单胞菌病提供依据。

1 材料与方法
1.1 病料
病料取自江苏某特种水产养殖场，濒死暗纹东方鲀（图1，图2）体表出血，鳍条缺失、出血，肛门红肿、突出。

解剖后发现，腹腔极度积水，肝脏肿大、出血。

1.2 实验动物
图1 濒死暗纹东方鲀病料
图2 暗纹东方鲀解剖症状图
清洁级6周龄成年雄性ICR小鼠，体重（25±2）g，由南通大学实验动物中心提供。

暗纹东方鲀购自水产市场，每尾重80～100 g，试验前在持续流水的水泥池（500 L）中驯养2周，证实健康无病后用于试验。

试验期间水温控制在25℃左右，投喂暗纹东方鲀专用配合饲料。

1.3 试剂
Taq DNA酶和DNA Marker（DL 2000）购自TaKaRa公司；细菌微量生化鉴定管、药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司，小量细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司（批号SK8255），其他试剂均为分析纯。

1.4 病原分离
选择具有典型症状、濒死的暗纹东方鲀，无菌操作取其心脏、肝脏，大豆酪蛋白琼脂培养基（Tryptose soya agar，TSA）平板划线分离细菌，30℃培养 24 h，选取优势菌在TSA平板上纯培养，挑取单个菌落进行革兰氏染色，光学显微镜下观察。

将分离菌株用斜面保存。

1.5 生化试验
取斜面保藏菌株进行动力试验及微量生化管试验。

动力试验用半固体营养琼脂穿刺培养。

微量生化管试验按产品使用说明操作。

1.6 溶血活性检测
将分离菌接种至血液琼脂（含7%家兔脱纤血的营养琼脂）培养基，30℃培养24 h，观察菌落周围是否出现溶血圈。

1.7 毒力试验
将分离菌接种至胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基，30℃ 静置培养36 h，5 000 r／min离心10 min，收集菌体，0.15 mol／L NaCl稀释菌体，用活菌计数法［1］测定菌液浓度，并将菌液稀释为1.8×108、0.9×108、1.8 ×107、0.9×107、1.8 ×106、0.9×106、1.8 ×105、0.9×105 CFU／mL共8个浓度梯度，每个浓度接种6只ICR小鼠（腹腔注射，0.2 mL/只）和10尾健康暗纹东方鲀（鳍背注射，0.2 mL/只），对照组注射等量的无菌生理盐水。

连续观察7 d并记录小鼠和暗纹东方鲀的死亡时间和数量。

按Reed－Muench法计算分离菌的半数致死量
（LD50）。

1.8 16 S rDNA基因序列测定与系统发育学分析
1）PCR模板DNA的制备。

将分离菌株接种于TSB培养基，30℃培养16 h，小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌体DNA作为PCR模板。

2）16 S rDNA基因序列的PCR扩增与测序。

设计16 S rDNA基因的2条通用引物：27F（正向引物）：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；1492R（反向引物）：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′，引物由上海英俊生物技术有限公司合成，－20℃保存备用。

50 μL 反应体系：无菌超纯水36 μL，10×PCR Buffer 5 μL，1.5 mmol／L MgCl24 μL，4×dNTPs 1.0 μL，引物各0.5 μL ，2.5 U／μL 的 Taq DNA 聚合酶1.0 μL，模板DNA 1 μL。

PCR反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性 1 min，55℃复性 1 min，72℃延伸 2 min，30个循环；72℃
温育6 min。

PCR扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因序列
测定。

3）16 S rDNA基因序列同源性分析及系统发育树构建。

通过 NCBI的 BLAST检
索系统（http：／／／Blast／）对供试菌株的 16 S rDNA基因序列进行同源性分析后，从结果中获取相似的23种气单胞菌菌株16 S rDNA基因序列，并利用Mega 4软件构建系统发育树。

1.9 药敏试验
根据第一批正式转为国家标准的渔药目录［2］，选取复方新诺明、新霉素、氟苯尼考、氧哌嗪青霉素、四环素、强力霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素药敏试纸，按试纸说明进行试验，并用保藏的Escherichia coil BL21作为对照菌，30℃培养16 h观察结果。

2 结果与分析
2.1 分离菌的形态及培养特性
光学显微镜下观察，分离菌为革兰氏染色阴性、散在、两端钝圆、无芽孢的小杆菌。

经30℃培养24 h，菌落在TSA平板上为不透明、表面光滑、略凸、直径3～4 mm、边缘整齐的乳白色菌落；在血液琼脂培养基上（含7%家免脱纤血的营养琼脂）培养24 h呈β－溶血。

2.2 分离菌的生理生化特性
取斜面保藏菌株进行动力试验及微量生化管试验，结果显示该菌具有动力性，不发酵木糖、鼠李糖、山梨醇等，不产硫化氢，尿素试验阴性，半乳糖和枸橼酸盐试验阳性，其他生化特性见表1。

通过细菌生化试验，初步确认该菌为维氏气单胞菌，命名为NTHV。

表1 分离菌的生理生化特性注：“+”表示生化反应呈阳性；“-”表示生化反应
呈阴性。

试验项目动力氧化酶接触酶硫化氢明胶枸橼酸盐葡萄糖产酸葡萄糖产气山
梨醇麦芽糖半乳糖精氨酸双水解酶乳糖苯丙氨酸脱氨酶七叶苷水杨苷鼠李糖尿素结果结果+++-++++-++++++---试验项目O-F试验蔗糖蜜二糖棉子糖菊糖苦杏仁苷丙二酸盐6%氯化钠吲哚木糖海藻糖果糖糊精甘露醇甘露糖肌醇纤维二糖
++++----+-+++++-+
2.3 毒力试验结果
用不同浓度的分离菌NT－HV菌液分别接种I CR小鼠和健康暗纹东方鲀，小鼠每组6只，暗纹东方鲀每组10尾，接种后观察并记录每组的死亡情况，结果如表2所示。

分离菌NT－HV对小鼠和暗纹东方鲀均具毒力。

按Reed－Muench法计算该菌对小鼠和暗纹东方鲀的 LD50分别为 2.26×106CFU／mL、5.96×104CFU ／mL。

小鼠人工感染后主要临床症状为精神萎靡，食欲不振，脚趾、鼻尖出血；解剖症状为腹膜充血，肝脏坏死，肠道臌气，脾肿大。

暗纹东方鲀人工感染后主要临床症状为肛门红肿，体表及胸鳍、腹鳍和臀鳍基部充血、出血；解剖发现其肝脏肿大，有大小不一的出血斑块，肠黏膜出血。

表2 菌株NT-HV毒力试验结果菌液浓度//CFU/mL 1.8×108 0.9×108 1.8×107 0.9×107 1.8×106 0.9×106 1.8×105 0.9×105小鼠死亡数//只6 5 4 2 0 0 0 0暗纹东方鲀死亡数//尾10 10 10 8 6 5 4 1
2.4 16 S rDNA基因的测定及分析
以菌株NT－HV的基因组DNA为模板，PCR扩增16 S rDNA片段，测序结果显示克隆片段长1 444 bp。

将其基因序列用BLAST进行同源性比较，依据同源性检索结果，选取不同气单胞菌种属的代表株构建系统发育树，其与维氏气单胞菌16 S rDNA基因序列相似性为99%（图3）。

因而，从分子水平上进一步证实分离菌株NT－HV为维氏气单胞菌。

2.5 药敏试验结果
图3 基于气单胞菌不同种属菌株16 S rDNA序列构建的系统发育树
药敏试验结果显示氟苯尼考、复方新诺明、新霉素、氧哌嗪青霉素为该菌的敏感药物，四环素、强力霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素对该菌无作用，对照菌E.coil BL21对上述药物均有敏感性。

3 讨论
维氏气单胞菌又称凡隆气单胞菌、维罗纳气单胞菌，1983年美国疾病预防与控制中心为纪念法国微生物学家Veron在弧菌和气单胞菌研究中的贡献而命名。

该菌普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，其中一部分菌株在微生态环境中正常存在，而另一些菌株具有致病性，主要感染变温动物，如中华绒螯蟹、框镜鲤、中国大鲵、锦鲤、西伯利亚鲟等［3－7］，可引起大量死亡；维氏气单胞菌对恒温动物是一种条件致病菌，但有人认为免疫功能健全者也可被感染［8］，通常患者发生急性腹泻，也可能引起菌血症、脑膜炎和心内膜炎等［9，10］。

近年来，日益增多的病例表明维氏气单胞菌已成为一种重要的人-鱼共患致病菌，在食品安全上有重要的研究意义，部分国家已经将其规定为食品安全的检疫对象。

暗纹东方鲀俗称河豚，是具有极高经济价值的特种水产养殖对象，随着暗纹东方鲀人工繁殖、营养及无毒人工养殖等综合养殖技术的不断完善，暗纹东方鲀高密度、集约化养殖规模不断扩大，病害已成为制约该行业发展的主要因素之一。

维氏气单胞菌引起的暗纹东方鲀疾病在生产实践中已经出现并在同一养殖场连年发生，造成一定的经济损失。

本研究对暗纹东方鲀病变组织进行细菌分离纯化，获得一株致病性维氏气单胞菌，在国内外首次报道暗纹东方鲀相关疾病，为暗纹东方鲀维氏气单胞菌病的防控提供参考。

本研究将分离菌株NT－HV分别人工感染ICR小鼠和健康暗纹东方鲀，引起小鼠和暗纹东方鲀发生死亡，半数致死量都很小，证实分离株具有较强的致病性，这一结果和Sung等［11］报道的对虾的半数致死量相当。

通过三个养殖周期的记录分析，每年10月份气温逐渐下降，露天养殖的暗纹东方鲀进入温室，环境变化、
鱼体在转运过程中的应激反应等因素是导致疾病发生的原因，在该种疾病的防治过程中应引起重视。

抗菌药物的使用是动物生产和疫病防治的重要措施，但抗菌药物的不科学使用，致使药物残留、环境污染和细菌耐药已经成为一个世界关注的兽医公共卫生问题。

本研究药敏试验选取的药物是中国水产养殖中允许使用的常用药物，其中四环类素药物耐药性的产生原因值得关注，通过对养殖现场的调研发现土霉素是该场常用药，这可能是产生耐药性的主要原因之一，同时提示在药物的使用中应注意药物的浓度和合理轮换。

虽然本研究选取敏感药物有效控制了暗纹东方鲀的发病，但该菌的耐药性正逐渐形成，应予以高度重视。

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