实验四.免疫印迹
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凝胶的浓度与有效分离范围：
样品的浓缩效应
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的 缓冲液系统,在这一系统中，凝胶分为低浓度的 成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲 液也有不同的pH和离子强度。
当电泳时，凝胶中样品里的SDS多肽复合物沿 移动的界面迁移，在分离胶表面形成了一个极 薄的层，极大地浓缩了样品的体积
同时，在水溶液中，SDS—多肽复合物具有近似的形状(长 椭圆棒状)，并且不同SDS—多肽复合物的短轴长度趋于一 致，而长轴与分子量成正比。这样，SDS—多肽复合物， 在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再 受蛋白质多 肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在 一定条件下与迁移率成线性关系
凝胶的分子筛效应
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acry1amide，简 称Acr)和交联剂亚甲双丙烯酰胺(N,N-methylene bisacry1amide，简称Bis)在催化剂的作用下聚合 而成
凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同SDS—多 肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效 应。微孔的大小由于Bis和Acr的比例和凝胶的 浓度决定。
按图所示装好印迹电泳装置，注意蛋白
质转移方向 -
+，除去膜和滤纸间的
气泡
免疫学检测摇育过夜来自封闭加一抗摇育1h
加二抗
洗膜
摇育2h（3次，每次10min ）
洗膜
加底物
试验记录
方法
SDS-PAGE 凝胶的制备
SDS-PAGE贮备液（试剂中的A~F液）按 比例制备 分离胶(T=12％) 浓缩胶(T=5％ )
灌胶
灌分离胶 分离胶溶液迅速灌注 ，留出灌注浓缩胶 所需的空间（梳子长加1cm）
灌浓缩胶 分离胶聚合完全，灌入浓缩胶并立即插 入Teflon梳子（避免气泡）移出梳子，用 去离子水洗加样槽
上样、电泳
蛋白质变性 蛋白质样品与上样缓冲液按1:1的比例混合后， 100℃加热3min
加样 样品10μl/孔，无蛋白质样品时用上样缓冲液代替 电泳 恒流电泳 ，分离胶中电压提高，溴酚蓝标记移至底 部时终止电泳。
印迹电泳
电泳完毕，切胶，剪与胶等大的1张NC 膜及6张滤纸
凝胶、NC膜、滤纸、海绵衬垫用印迹电 泳缓冲液浸湿
电泳分离的电荷效应
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于SDS和巯基乙醇作用， 使得蛋白质分子中二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS 按1．4gSDS／lg蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上， 形成SDS—多肽复合物。
十二烷苯磺酸根带负电，使各种SDS—多肽复合物都带有 相同密度的负电荷，它的量大大超过了 蛋白质多肽分子原 有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子间原有 的电荷差别
材料
电泳装置 垂直板电泳槽（水平） 电泳仪 NC膜、Whatman 3MM滤纸
试剂
A液—30%丙烯酰胺储存液 B液 —1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液（pH8.8 ） C液 — 0.5mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8 ） D液 —双蒸水 E 液 — 10% SDS F液 —四甲基乙二胺（TEMED） G液 — 10﹪过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 、上样缓冲液 、印迹电泳 缓冲液 、封闭液 、脱色液
样品的浓缩效应
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的 缓冲液系统,在这一系统中，凝胶分为低浓度的 成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲 液也有不同的pH和离子强度。
当电泳时，凝胶中样品里的SDS多肽复合物沿 移动的界面迁移，在分离胶表面形成了一个极 薄的层，极大地浓缩了样品的体积
同时，在水溶液中，SDS—多肽复合物具有近似的形状(长 椭圆棒状)，并且不同SDS—多肽复合物的短轴长度趋于一 致，而长轴与分子量成正比。这样，SDS—多肽复合物， 在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再 受蛋白质多 肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在 一定条件下与迁移率成线性关系
凝胶的分子筛效应
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acry1amide，简 称Acr)和交联剂亚甲双丙烯酰胺(N,N-methylene bisacry1amide，简称Bis)在催化剂的作用下聚合 而成
凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同SDS—多 肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效 应。微孔的大小由于Bis和Acr的比例和凝胶的 浓度决定。
按图所示装好印迹电泳装置，注意蛋白
质转移方向 -
+，除去膜和滤纸间的
气泡
免疫学检测摇育过夜来自封闭加一抗摇育1h
加二抗
洗膜
摇育2h（3次，每次10min ）
洗膜
加底物
试验记录
方法
SDS-PAGE 凝胶的制备
SDS-PAGE贮备液（试剂中的A~F液）按 比例制备 分离胶(T=12％) 浓缩胶(T=5％ )
灌胶
灌分离胶 分离胶溶液迅速灌注 ，留出灌注浓缩胶 所需的空间（梳子长加1cm）
灌浓缩胶 分离胶聚合完全，灌入浓缩胶并立即插 入Teflon梳子（避免气泡）移出梳子，用 去离子水洗加样槽
上样、电泳
蛋白质变性 蛋白质样品与上样缓冲液按1:1的比例混合后， 100℃加热3min
加样 样品10μl/孔，无蛋白质样品时用上样缓冲液代替 电泳 恒流电泳 ，分离胶中电压提高，溴酚蓝标记移至底 部时终止电泳。
印迹电泳
电泳完毕，切胶，剪与胶等大的1张NC 膜及6张滤纸
凝胶、NC膜、滤纸、海绵衬垫用印迹电 泳缓冲液浸湿
电泳分离的电荷效应
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于SDS和巯基乙醇作用， 使得蛋白质分子中二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS 按1．4gSDS／lg蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上， 形成SDS—多肽复合物。
十二烷苯磺酸根带负电，使各种SDS—多肽复合物都带有 相同密度的负电荷，它的量大大超过了 蛋白质多肽分子原 有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子间原有 的电荷差别
材料
电泳装置 垂直板电泳槽（水平） 电泳仪 NC膜、Whatman 3MM滤纸
试剂
A液—30%丙烯酰胺储存液 B液 —1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液（pH8.8 ） C液 — 0.5mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8 ） D液 —双蒸水 E 液 — 10% SDS F液 —四甲基乙二胺（TEMED） G液 — 10﹪过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 、上样缓冲液 、印迹电泳 缓冲液 、封闭液 、脱色液