巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立
郭捷;谢芝勋;罗思思;刘加波;邓显文;谢志勤;庞耀珊;范晴
【摘要】为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应.特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板.本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2013(040)009
【总页数】4页(P23-26)
【关键词】H1亚型禽流感病毒;巢式PCR;检测
【作者】郭捷;谢芝勋;罗思思;刘加波;邓显文;谢志勤;庞耀珊;范晴
【作者单位】广西大学,动物科学技术学院,广西南宁530004;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001;广西壮族自治区兽医研究所,广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁 530001
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
禽流感(avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的A型流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的各种家禽及野生禽类感染和/或疾病综合征(甘孟侯，1995)。

AIV主要感染家禽(如鸡、鸭等)，可对感染宿主的呼吸道造成严重
损伤，使宿主表现出不同程度的临床症状，严重者可造成家禽大面积的感染和死亡。

根据AIV外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同可分为16个HA亚型和9个NA亚型。

作为AIV的自然宿主，水禽、岸基鸟和鸥理论上可感染所能分离出的所有AIV亚型，并由它们经粪便将病毒排出体外，造成环境污染特别是水系污染，
进一步将病毒传播出去，也可由南北迁徙的候鸟将病毒进一步扩散(马寅生等，2009;Webster等，1992)。

随着AIV检测技术的不断成熟和发展，结果发现除家禽外，在一些哺乳动物体内
也能检测到AIV的存在。

H1亚型流感病毒在人和猪体内的检测发现日益增多，造成的危害不容忽视。

但对于H1亚型AIV快速且敏感的检测方法在该领域研究较少。

20世纪90年代之后，国内外众多学者在PCR技术广泛应用的基础上，发展
并形成了巢式PCR技术(nested PCR，nPCR)。

目前，巢式PCR技术已在许多方面得到了广泛应用(谢芝勋等，2002;杨素等，2012;唐熠等，2010;王莹等，2010)。

由于采用2对不同的引物且2次连续放大，故可提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性，使灵敏度和特异性在理论上高于传统的PCR技术。

因此，本研究通
过建立针对H1亚型AIV的巢式PCR检测方法，为其诊断提供快速简便的技术，
同时也增强其在PCR反应中的特异性和敏感性。

1 材料与方法
1.1 毒株 H1、H3、H6和 H9亚型 AIV均由广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点
实验室分离鉴定;H5N2和H7N2亚型AIV RNA均由美国康州大学禽病诊断研究
室惠赠;新城疫病毒(NDV)F48株、传染性支气管炎病毒(IBV)M41株、传染性喉气管炎病毒(ILTV)北京株及鸡毒霉形体(MG)86均由广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室保存。

1.2 试剂 RNA提取试剂TRIzol LS Reagent购自Invitrogen公司;AMV反转录酶和 dNTP均购自TaKaRa公司;2×Taq PCR Mix和质粒小量提取试剂盒均购自北
京天根生物技术公司。

1.3 引物设计与合成从GenBank中下载已发表的H1亚型AIV HA基因核苷酸序列，找到较为保守的区域，利用Primer Premier 5.0生物软件设计合成2对特异
引物(内、外引物)(表1)，引物均由Invitrogen公司合成，稀释成50 pmol/μL，
于-20℃保存备用。

1.4 病毒RNA抽提与反转录参照TRIzol LS Reagent使用说明书和Lee等(2001)的介绍进行病毒RNA抽提。

向抽提后的RNA中加入35 μL DEPC水、1.5 μL 反
转录引物，70 ℃ 反应 10 min，冰浴5 min，加入5×M-Mulv Buffer 10 μL、dNTP 2 μL、RNA 酶抑制剂0.5 μL、AMV 1 μL，瞬时离心，42 ℃放置90 min。

制备的cDNA于-30℃保存备用。

表1 内、外引物序列信息引物引物序列(5'→3') 扩增大小(bp)H1外-F TGGCTCCTGGGCAACCCAGAA 602 H1外-R CCCTTATTTAGTGCGAAGGCATACCAT H1内-F AAGGCAARCTCRTGGCCAA 278 H1内-R GTGAATCTCCGGTTGTAC
1.5 巢式PCR条件的优化 PCR反应体系25 μL:2 × PCR Master Mix 1
2.5 μL，
待检总cDNA 2 μL，上、下游引物(50 pmol/μL)各加入 0.1～0.5 μL 5个梯度浓度进行引物浓度优化，最后加dH2O至25 μL。

先用外引物依照25 μL反应体系
进行第1轮扩增，再将第1轮的扩增产物作为模板，用内引物进行第2轮扩增。

据试验结果，对2对引物使用量、退火温度、扩增循环数、第1轮扩增产物稀释
度和第2轮扩增所需模板量进行优化。

1.6 巢式PCR的特异性试验利用本研究优化后的巢式 PCR反应体系，同时扩增
H1、H3、H5、H6、H7和H9亚型 AIV及NDV、IBV、ILTV和MG的核酸，检测其特异性。

1.7 巢式PCR的敏感性试验将制备好的H1亚型AIV号RNA按10倍倍比稀释，利用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA 浓度，分别
为132 pg/μL、13.2 pg/μL、1.32 pg/μL、132.0 fg/μL、13.2 fg/μL、1.32
fg/μL。

对各浓度RNA反转录后进行第1轮扩增，再以第1轮产物为模板对应进
行第2轮PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳观察该方法的敏感度。

1.8 与普通PCR敏感性比较将10倍倍比稀释好的H1亚型AIV RNA，按常规PCR方法进行检测。

PCR 反应体系25 μL:2×PCR Master Mix 1
2.5 μL，H1 内-F 和 H1 内-R 各(50 pmol/μL)0.5 μL，待检总cDNA 2 μL，dH2O 9.5 μL。

瞬时
离心。

PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，56℃退火40 s，72 ℃
延伸 50 s，共 35 个循环;72℃延伸10 min;4℃结束。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察该方法的敏感度，同时与巢式PCR结果进行比较。

2 结果与分析
2.1 巢式PCR条件的优化通过对巢式PCR反应条件的优化，最后确定PCR反应
体系和模式。

第1轮 PCR 反应体系25 μL:2×PCR Master Mix 12.5 μL，H1 外-
F 和 H1 外-R(50pmol/μL)各0.3 μL，待检总cDNA 2 μL，dH2O 9.9 μL。

PCR
反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，20 个循环;72 ℃延伸10 min;4℃结束。

将第1轮的反应产物100倍稀释后，作为第2轮反应的模板。

第2轮PCR反应体系25 μL:2×PCR Master Mix 12.5 μL，
H1 内-F和 H1 内-R(50 pmol/μL)各0.2 μL，第 1 轮产物稀释后模板1 μL，dH2O 11.1 μL。

PCR 反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，57℃退火50 s，72℃延伸1 min，20个循环;72℃延伸10 min;4℃结束。

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现，第1轮PCR产物扩增效果并不理想，目的条带不太明显，而经过第2轮PCR扩增后在278 bp处显示出明显的特异性目的条带(图1)，结果表明该巢式PCR方法能检测出H1亚型AIV HA基因。

图1 巢式PCR优化结果注:M，100 bp DNA Ladder;1，第1轮 PCR 产物;2，第1轮 PCR阴性对照;3，第2轮PCR产物;4，第2轮PCR阴性对照。

2.2 特异性试验结果特异性试验结果显示，经过2轮PCR反应，只有H1亚型AIV有特异性条带出现，大小为278 bp，与预期结果一致;而其他亚型流感病毒和禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带(图2)，结果表明该方法有较好的特异性。

图2 巢式PCR的特异性试验结果注:M，100 bp DNA Ladder;1～6，H1、H3、H5、H6、H7、H9 亚型AIV;7，NDV;8，MG;9，IBV;10，ILTV;11，阴性对照。

2.3 敏感性试验结果试验结果显示，第1轮PCR扩增产物仅能扩增出1.32 pg/μL 的目的条带(图3)，而第2轮PCR扩增最低能检测到1
3.2 fg/μL的H1亚型
AIV(图4)。

结果表明，第2轮PCR扩增的敏感性是第1轮PCR的100倍。

图3 第1轮巢式PCR的敏感性试验结果注:M，100 bp DNA Ladder;1，132
pg/μL RNA;2，13.2 pg/μL RNA;3，1.32 pg/μL RNA;4，132 fg/μL RNA;5，13.2 fg/μL RNA;6，1.32 fg/μL RNA;7，阴性对照。

下同。

图4 第2轮巢式PCR的敏感性试验结果
2.4 与普通PCR敏感性比较电泳结果显示，普通PCR检测方法最低能检测到
1.32 pg/μL的H1亚型AIV(图5)，而巢式PCR能检测出13.2 fg/μL的H1亚型AIV。

图5 普通PCR的敏感性试验结果注:M，100 bp DNA Ladder;1，132 pg/μL
RNA;2，13.2 pg/μL RNA;3，1.32 pg/μL RNA;4，132 fg/μL RNA;5，13.2
fg/μL RNA;6，1.32 fg/μL RNA。

3 讨论
AIV是一种高度接触性、急性传染病，可引起感染者从呼吸系统病变到全身败血的症状。

而根据HA与NA的不同将AI分成几百种血清亚型(李冬野等，2004)。

由
于几个血清型交叉反应性低，极易发生多种血清型的基因重排和突变现象，为AIV 诊断和预防带来了很大的困难(但晓雅等，2012)。

对于H1亚型AIV，因其低致病性，在禽类感染者中不表现出明显的临床症状，更加大了鉴别诊断难度。

同时在欧洲和亚洲，却已有多次H1N1亚型AIV传播给猪的报道，甚至影响人类的健康。

追溯到1918年的西班牙流感、1957年的亚洲流感、1968年的香港流感都对人
类造成了极大的危害。

之后有关研究报道指出3次流感病毒基因均发生了不同亚
型间基因片段的重配现象，并通过某个中间宿主(如猪)将禽类和人两者联系在一起，从而使AIV在不断重排基因和突变由弱毒株转化成强毒株，从禽类突破种间屏障
感染到人，引起灾难性后果(Castrucci等，1993;Guan等，1996)。

进入21世纪后，2009年的甲型H1N1流感再次造成了一次流感大流行，且从流感患者身上分离出的流感病毒新毒株，包含猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的基因片段，足以证明类似H1亚型AIV的低致病性AIV虽在禽类潜伏不表现临床症状，却不
能忽视其为暴发人类流感的流感病毒提供基因片段这一事实，从而间接危害人类的身体建康(王大燕等，2011;Liu等，2012)。

因此，本研究针对H1亚型AIV HA
基因设计2对特异性引物，使引物能扩增出只针对H1亚型AIV的目的片段，对
中国现有H1亚型AIV的检测具有十分重要的意义。

巢式PCR是Mullis等为了解决因起始模板量较低导致PCR试验不易成功的问题，在美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建的一种核酸体外扩增技术——聚合
酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)基础上进行改进，即在设计的第1
对引物(即外套引物，outer primers)的扩增区域内另外设计第2对引物(即内套引物，inner primers)并扩增(糜祖煌，2002)，通过“外”、“内”2对引物的扩增加大模板量，进一步倍增至可观察量。

因而，相较于普通PCR使用1对特异性引物，巢式PCR需2对特异性引物，第2对引物被设计为针对第1对引物扩增的片段内部进行第2次扩增，因而不仅提高了PCR反应特异性，同时也提高了其敏感性。

本研究在普通PCR基本原理基础上，通过H1亚型AIV HA基因比对分析，设计了2对特异性引物H1外-F、H1外-R和H1内-F、H1内-R，针对H1亚型AIV模板进行2轮PCR扩增，通过对PCR反应体系和条件的优化，建立了巢式PCR。

在该巢式PCR扩增中，电泳结果显示，分别扩增出预期的602和278 bp 的目的条带。

特异性试验结果表明，该PCR方法只能与H1亚型AIV反应，而对其他亚型AIV及禽呼吸道疾病病毒不扩增，具有高度特异性，此外，该方法较常规PCR更为精确，通过2轮特异性扩增提高了产物的特异性，因而比普通PCR更为特异。

敏感性试验结果表明该PCR具有高度的敏感性，且通过敏感性比较，结果显示，比常规PCR敏感性高100倍。

由于巢式PCR第2轮PCR扩增的模板是第1轮的扩增产物，若直接加入会因为模板量太高而导致第2轮扩增失败。

所以，通过试验不断优化，在第2轮扩增时加入的产物模板需稀释100倍，才能达到很好的PCR反应效果。

此外，在稀释第1轮扩增产物时，应注意防止扩增产物污染，因而建议扩增产物稀释和第2轮PCR反应体系配制分区域进行，并加入阴性对照进行比较，从而保证试验的精确性。

虽然相对于普通PCR反应，巢式PCR需进行2次PCR反应，但每次的反应时间相较于普通PCR均缩短了将近1倍，所以，总体反应时间与普通PCR一样具有快速性。

本研究建立的H1亚型AIV巢式PCR方法具有精确性高、特异性好、灵敏度高等特点，为H1亚型AIV的快速检测提供了新方法，对其有效防制有重要意义，具
有较好的应用前景。

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