质粒抗性——精选推荐

质粒抗性
质粒
质粒是真核细胞细胞核外或原核⽣物拟核区外能够进⾏⾃主复制的遗传单位，包括真核⽣物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分⼦。

现在习惯上⽤来专指细菌(⼤肠杆菌）、酵母菌和放线菌等⽣物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分⼦。

在基因⼯程中质粒常被⽤做基因的载体。

许多细菌除了拟核中的DNA外，还有⼤量很⼩的环状DNA分⼦，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。

质粒上常有抗⽣素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。

有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染⾊体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染⾊体外的DNA分⼦。

⽬前，已发现有质粒的细菌有⼏百种，已知的绝⼤多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分⼦(简称cccDNA)。

细菌质粒的相对分⼦质量⼀般较⼩，约为细菌染⾊体的0.5%～3%。

根据相对分⼦质量的⼤⼩，⼤致上可以把质粒分成⼤⼩两类：较⼤⼀类的相对分⼦质量是40×106以上，较⼩⼀类的相对分⼦质量是10×106以下(少数质粒的相对分⼦质量介于两者之间)。

每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本⾝的复制特性。

按照复制性质，可以把质粒分为两类：⼀类是严紧型质粒，当细胞染⾊体复制⼀次时，质粒也复制⼀次，每个细胞内只有1～2个质粒；另⼀类是松弛型质粒，当染⾊体复制停⽌后仍然能继续复制，每⼀个细胞内⼀般有20个左右质粒。

这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果⽤⼀定的药物处理抑制寄主蛋⽩质的合成还会使质粒拷贝数增⾄⼏千份。

如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到
更⾼拷贝数。

⼀般分⼦量较⼤的质粒属严紧型。

分⼦量较⼩的质粒属松弛型。

质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在⼤肠杆菌内的复制属严紧型，⽽在变形杆菌内则属松弛型。

在基因⼯程中，常⽤⼈⼯构建的质粒作为载体。

⼈⼯构建的质粒可以集多种有⽤的特征于⼀体，如含多种单⼀酶切位点、抗⽣素耐药性等。

常⽤的⼈⼯质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单⼀切点。

如果将DNA⽚段插⼊EcoRI切点，不会影响两个抗⽣素基因的表达。

但是如果将DNA⽚段插⼊到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。

这时，含有DNA插⼊⽚段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。

没有DNA插⼊⽚段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素⼜抗四环素，⽽没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。

pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。

质粒运载体的最⼤插⼊⽚段约为10 kb(kb表⽰为千碱基对)。

名称长度抗性特殊性能
PAO815 7709 bp Amp 酵母表达
pAxCAwt 44741 BP Amp 腺病毒表达
pAxcw 42410 bp Amp 腺病毒表达
pAAV-MCS 4.7 kbp Amp 哺乳动物细胞
表达
pBacPAK8 5.5 k Amp 杆状病毒表达
PBI121 13.0 kbp Kan 植物细胞表达pBV220 3665 bp Amp 原核表达pCAMBIA 1300 植物细胞表达pCAMBIA 1301 11837 bp Kan 植物细胞表达
pCAT3-Basic 4047 bp Amp
pcDNA 3 5446 bp Amp 哺乳动物细胞
表达
pcDNA 3.1(+) 5428 bp Amp 哺乳动物细胞
表达
pcDNA 3.1/ mys-HisA 5494 bp Amp 哺乳动物细胞
表达
pCl-neo 5472 bp Amp 哺乳动物细胞
表达
表达
pET-3a 4640 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-11a 5677 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-15b(+) 5708 bp Amp ⼤肠杆菌表达
pET-20b(+) 3716 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-22b(+) 5493 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-23a(+) 3666 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-23b(+) 3665 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-23c(+) 3664 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-23d(+) 3663 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-
28a(+) 5369 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-28b(+) 5368 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-28c(+) 5367 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-30a(+) 5422 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-30b(+) 5421 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-30c(+) 5423 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-31b(+) 5742 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-32a(+) 5900 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-32b(+) 5899 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-32c(+) 5901 bp Amp ⼤肠杆菌表达pET-39b 6106 bp Kan ⼤肠杆菌表达pET-42a 5930 bp Kan ⼤肠杆菌表达
pGAPZ aA 3147 bp Zeo 酵母表达pGBKT7 7.3 kbp Kan 酵母表达pGEM3Zb 原核表达pGEM3Zf(+) 原核表达pGEM7Zf(+) 原核表达pGEX-2T 4969 bp Amp 原核表达pGEX-4T-1 4969 bp Amp 原核表达pGFP-N2 4732 bp Kan 哺乳动物细
胞荧光蛋⽩
表达pEGFP-C1 4731 bp Kan 哺乳动物细
胞荧光蛋⽩
表达pEGFP-C3 4727 bp Kan 哺乳动物细
胞荧光蛋⽩
表达pEGFP-N1 4733 bp Kan 哺乳动物细
胞荧光蛋⽩
表达
pLEGFP-N1 6892 bp Amp 哺乳动物细
胞荧光蛋⽩
表达
pGL3-Basic 4818 bp Amp
pGL36
pLNCX 6620 bp Amp 反转录病毒表
达
pLNHX 5.6 kbp Amp 反转录病毒表
达
pLXSN 5.9 kbp Amp 反转录病毒表
达
pLXIN 6.1 kbp Amp 反转录病毒表
达
pMAL-p2x 6721 bp Amp 原核融合蛋⽩
表达
pMAL-c2x 6721 bp Amp 原核融合蛋⽩
表达
pPIC3.5K 9004 bp Amp/Kan 酵母表达pPIC9 8024 bp Amp 酵母表达pPIC9K 9276 bp Amp 酵母表达
pPICZ aA 3593 bp Zeo 酵母表达
胞荧光蛋⽩
表达
pQE-30 3461 bp Amp 原核表达
pQE-9 3439 bp Amp 原核表达
pRevTRE 6487 bp Amp 反转录病毒表
达
pSE420L 4617 bp Amp
pTac I Amp 原核表达
pTac I(BamH I) Amp 原核表达
pTAL-Luc 4956 bp Amp 哺乳动物细胞
表达
pTWIN1 7375 bp Amp
pTXB1 6706 bp Amp
pVAX1 2999 bp Kan
质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：
1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺⼝闭环、开环。

经常会出现。

2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。

3）⼀条带，超螺旋。

⾄于那种情况好，要看我们进⼀步实验的⽬的了。

1）进⾏分⼦克隆的操作，构建载体。

这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。

所以在这种情况下，没必要评⽐谁好谁不好。

2）进⾏细胞转染。

因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是：3）、2）、1）。

还有⼀种:变性的超螺旋，原因是菌体与溶液II 接触的时间过长。

分⼦克隆对此现象也有提到。

有⼀个共同点：它们都没有认为这是个问题，因为该条带的存在对后续实验没有任何影响。

如果该条带⽐例过⼤，适当减少加⼊溶液II 后的裂解时间，以得率的少量损失为代价，是可以部分改善的。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。

在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产⽣其它形式的质粒DNA。

如果质粒DNA两条链中有⼀条链发⽣⼀处或多处断裂,分⼦就能旋转⽽消除链的张⼒,形成松驰型的环状分⼦,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同⼀处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。

当提取的质粒DNA电泳时,同⼀质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要⽐开环和线状分⼦的泳动速度快。

所谓穿梭质粒是指⼀类⼈⼯构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因⽽可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。

此概念不仅⽤于不同的微⽣物菌群之间，也可以推⼴到真核⽣物表达载体的构建，如⽤于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和⽤于植物细胞的Ti 质粒。

这些穿梭质粒不仅可以在⼤肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。

这样利于对质粒的分⼦⽣物学操作和⼤量制备。

表达质粒就是指带有启动⼦，增强⼦等等，使其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过转录翻印，在宿主内表达出相应蛋⽩的质粒
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