牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Tpr的表达、纯化和初步晶体学研究

Ｖｏ １ ． ４ ９ №５ ｏｃ ｔ ． ２ ０ １ ６
文 章 编 号 ：０ ４ ６ ５ — ７ ９ ４ ２ （ ２ Ｏ １ ６ ） ０ ５ － ０ ０ １ ４ － ０ ６
牙龈 卟啉单胞 菌蛋 白酶 Ｔ ｐ ｒ 的表达 、 纯化和初步 晶体学研究
张琼林， Ｍａ ｒ ｋ Ｂ ａ ｒ ｔ胞菌蛋 白酶 Ｔ ｐ ｒ 的表达 、 纯化和初步晶体学研究
・１ ５・
化介质 ， 离子交换柱 ， 分子筛和ＡＫ Ｔ Ａ纯化仪均购买 自Ｇ Ｅ 公 司； 蛋 白结晶条件试剂盒购买 自Ｈ ａ ｍｐ ｔ ｏ ｎ 公 司； 限制性 内切酶和 Ｔ ４ 连接酶购买 自Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ 公司 ； 大肠杆菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 感受态购买 自北京全式金生物技
它 能够 分 泌许 多 蛋 白酶 ， 用 于 降解宿 主 和环 境 中 的蛋 白质 ， 供 给 自身 营养 ． 这些 蛋 白酶 同时具 有 降解 免疫
球蛋 白， 使细胞 因子及其受体失活 ， 削弱白细胞的抗菌活性 ， 破坏宿主组织 ， 增加血管渗透性 ， 促进 出血等
功能 ， 是 牙周 炎 的重要 致病 因子 ． 巯基 蛋 白酶 Ｔ ｐ ｒ ￣ Ｅ 是 这些 蛋 白酶 中 的一 种 ．
术 有 限公 司 ．
（ 南 开大学 生命科学学 院，天津 ３ ０ ０ ０ ７ １ ） 摘要 ：牙龈 卟啉单胞菌是 一种能够 引起 牙周炎 的 口腔病原菌 ， 能够 分泌许多种 蛋 白酶 ． 这些蛋 白酶在 获得 营养 、 逃脱宿主免疫 、 粘 连组织细胞 和其 它疾病进程 中发挥 了重要 作用 ， 被认 为是 牙周炎 的重要 致病因子 ． 其 中
第４ ９ 卷
第５ 期
南 开 大 学 学 报（ 自然科学版 ）
Ａ Ｃ ｔ ａ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｒ ｕ ｍ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｎａ ｎ ｋ ａ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ
２ ０ １ ６ 年 １ ０ 月
１ 材 料 和 方 法
１ ． １ 材 料
包含 ｒ 基 因全 长 的质粒 模 板 由香港 大学 Ｒｏ ｒ ｙ Ｍ．Ｗａ ｔ ｔ 实验 室提 供 ； 表达 载体 ｐ ＧＥ Ｘ一 ６ ｐ —ｌ ， 亲 和纯
收 稿 日期 ：２ ０ １ ６ － ０ １ －１ ５
基金 项 目： 天津市 应用 基础研 究计 划项 目（ １ ３ Ｊ Ｃ ＹＢ Ｊ Ｃ ２ ０ ８ ０ ０ ） ； ９ ７ ３ 计划前 期研 究专 项 （ ２ ０ １ ４ Ｃ Ｂ ５ ６ ０ ７ ０ ９ ） ； 国家 自然 科
学基金面上项 目（ ３ １ ５ ７ ０ １ ２ ８ ） 作者简介 ： 张琼林 （ １ ９ ８ ８ 一） ， 男， 河南 洛阳人 ， 博士．
通讯作者 ： Ｍａ ｒ ｋ Ｂ ａ ｒ ｔ ｌ ａ ｍ（ １ ９ ７ ４ 一） ， 男， 英 国纽尼顿人 ， 教授 ， 研究方 向 ： 结构生物学 ．Ｅ ｍａ ｉ ｌ ： ｂ ａ ｒ ｔ ｌ ａ ｍ＠ｎ ａ ｎ ｋ ａ ｉ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
关键词 ：牙周炎 ； 蛋白酶 ； Ｔ ｐ ｒ ； Ｘ射线 衍射 ； 晶体结构
中 图 分 类 号 ：Ｑ ７ １ 文 献 标 识 码 ：Ａ
０ 引 言
牙周炎是一种 由细菌感染引起 的牙周支持组织慢性炎症 ， 是一种破坏性疾病 ， 会导致牙周组织 的损 伤， 甚至牙齿脱落 ， 影响到全世界 １ ０ － １ ５ ％人 口的口腔健康 阻 ］ ． 近期 临床医学和流行病学的研究结果表明牙 周炎 是 类风 湿性 关 节 炎 中 自身免 疫反 应 的诱 导 因素 之一 口 ， 同 时牙周 炎 与动 脉 粥样 硬化 、 心 血 管疾 病 和糖
尿病 的发 展有 关 联 口 ＇ ． 牙龈 卟啉 单胞 菌 （ Ｐ ｏ ｒ ｐ ｈ ｙ ｒ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ｇ ｉ ｎ ｇ ｉ ｖ ａ ｌ ｉ ｓ ） 是 牙 周 病 主要 致 病菌 之 一 ＿ ５ ］ ， 它 与福 赛
斯坦纳菌和齿垢密螺旋体共同发挥作用 ， 控制牙龈菌斑不断发展 ， 使牙周炎越来越严重 ］ ． 牙龈卟啉单胞菌
本 研究 组 以致 病 菌 蛋 白酶 Ｔｐ ｒ 为研 究对 象 ， 通 过 原核 系统表 达 、 纯 化 获得 纯 度较 高 的 蛋 白质 ， 经 结 晶
条件 的筛选和优化获得衍射能力较好的蛋 白质 晶体 ， 进行 ｘ 射线衍射数据收集和处理 ， 为结构的解析做好
了充 分 的准备 ， 以期通 过结 构解 析 为将来 设计 相关 的小分 子药 物提 供结 构基 础 ．
一
种蛋 白酶是巯 基蛋 白酶 Ｔ ｐ ｒ ， 它能够降解许 多常见蛋 白酶的底物 ， 其活性受 到营养状态 和钙 离子浓度 的调 节 ．
本实验在大肠杆菌 中表达得到 Ｔ ｐ ｒ 蛋 白， 经多种方法纯化后筛选 获得蛋 白质晶体 ． 通过 ｘ射线衍射实验收集到分
辨率达到 ０ ． ２ ０ｎ ｍ的衍射数据 ， 并使用软件 Ｈ ＫＬ ２ ０ ０ ０ 进行 了处理 ． 这些数据为解析 Ｔ ｐ ｒ ３ 维晶体结构奠定了基础 ．
巯 基蛋 白酶 Ｔ ｐ ｒ 于１ ９ ９ ２ 年 被发 现 ］ ， 其 活性 中心 在序 列 上与 木 瓜蛋 白酶 （ Ｃ１ ） 、 钙 蛋 白酶 （ Ｃ ２ ） 等 半胱
氨酸蛋 白酶家族较为类似 ． 有研究表明 Ｔ ｐ ｒ 可降解常见的蛋白酶底物 ， 如： 酪蛋白、 牛血清 白蛋 白、 纤维蛋 白原 和明胶等 ， 也 可以切割细 菌胶原酶 多肽底物 Ｐ ｚ 肽段 ， 但是对 于胰 蛋 白酶 和二肽酶底物 则无法 降 解［ １ ６ － １ ７ ３ ． Ｔｐ ｒ 的表 达 和活性 受 到外 部营 养环 境 的影 响 ， 同时其 活性 和稳定 性 也 由钙离 子浓 度进行 调 节［ １ ８ － ｅ ｏ ］ ．