白头翁皂苷B4体外抑制人肝癌细胞HepG2增殖并诱导其凋亡

白头翁皂苷B4体外抑制人肝癌细胞HepG2增殖并诱导其凋
亡
王海侠;郑新勇;郜尽
【摘要】Objective To screen the potential effective components in Pulsatilla chinensis for treatment for liver cancer, and explore the anti-cancer mechanism. Methods Pulchinenoside was isolated from Pulsatilla chinensis, human liver cancer cell line HepG2 was served as target cell, and the inhibiting effects of pulchinenoside on HepG2 cells were evaluated by MTT assay. Cell cycle arrest was determined by flow cytometry, cell apoptosis was detected by DNA fragmentation method, and Caspase 3 activity was measured. The possible responsible signal pathway for cell apoptosis was explored. Results Pulchinenoside B4 significantly inhibited proliferation of HepG2 cells, and the maximum inhibitory rate was 71.5%. Cell cycle analysis indicated that 83. 2% of cells were arrested at G2 phase at most. Flow cytometry revealed that cell apoptosis was dependent of time of incubation with 40 mg/mL pulchinenoside B4, cell apoptosis rate increased from nearly 0 to 14. 3% at most with time increase from 0 to 48 h, and DNA fragmentation occurred. Further study indicated that pulchinenoside B4 significantly upregulated Caspase 3 activity in HepG2 cells. Conclusion Pulchinenoside B4 regulates the cell cycle of liver cancer cells, causes cell cycle arrest at G2/M, and induces cell apoptosis, which is a potential chemical for the treatment of liver cancer.%目的筛查中药白头翁抗肝癌有效成分,探索其抗癌机制.方法分离白头翁皂苷成分,以人肝癌细胞HepG2为
作用靶细胞,MTT法测定其对细胞增殖的抑制,流式细胞术检测细胞周期阻滞,DNA 片断化方法检测细胞凋亡情况,检测半胱氨酸蛋白酶3酶活性,从信号通路的角度探寻其诱导凋亡的机制.结果白头翁药材含量较高的成分白头翁皂苷B4对HepG2具有显著的抑制作用,最大抑制率达到71.5％；通过细胞周期分布分析,发现最多有83.2％的细胞被阻滞在G,期；用流式细胞仪研究其凋亡情况发现,在40 mg/mL药物浓度作用下,细胞凋亡与孵育时间呈现依赖关系,随着时间从0到48 h,初期凋亡比例从接近于零最高增长到14.3％,并且发生了DNA片段化；进一步研究发现,白头翁皂苷B4处理后的HepG2细胞半胱氨酸蛋白酶3活性显著升高.结论白头翁皂苷B4调控肝癌细胞周期,阻滞G2/M期更替,诱导细胞凋亡,是肝癌治疗的潜在候选分子,奠定了白头翁药材用于肝癌治疗的理论基础.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(031)010
【总页数】5页(P1481-1485)
【关键词】白头翁皂苷B4;肝癌细胞;细胞周期阻滞;凋亡;流式细胞仪;半胱氨酸蛋白酶3
【作者】王海侠;郑新勇;郜尽
【作者单位】安徽科技学院理学院,凤阳 233100;巢湖市公安局刑侦支队,巢湖238000;上海交通大学药学院,上海 200240
【正文语种】中文
【中图分类】R285;R979
白头翁为毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢之功效［1］，数百年来一直被用于治疗阿米巴原虫感染等疾病。

近年来，有很多证据［2-4］表明，该药材可对黑色素瘤、肉瘤和宫颈癌等均有效。

特别是有文献报道从该药材中提取出的一种皂苷元对小鼠肝癌细胞有抑制作用［5］。

肝癌作为世界第三大癌症，是发展中国家的常见病症，80%的致死病例均发生在
发展中国家，仅我国就占55%［6］。

通过天然药物筛查，证明白头翁药材具有抗癌活性，从中寻找治疗肝癌的候选药物有重要意义。

白头翁药材资源丰富，在我国广大地区都有分布。

安徽滁州地区的白头翁皂苷含量比较高。

我们以滁州凤阳县的白头翁进行了肝癌抑制活性物质的筛查，分离了多种皂苷成分，测试了它们的抗癌活性，为白头翁药材在肝癌的治疗奠定理论基础。

本文报道的是白头翁皂苷B4对肝癌细胞株HepG2的抑制作用，并对其机制进行初步探索。

1 材料与方法
1.1 材料
人肝癌细胞(HepG2)由中国科学院上海生化细胞所提供;白头翁总皂苷由10月份采集的安徽省凤阳县产白头翁根茎，参照文献［7］方法制得。

采用2次硅胶层析分离得到单一成分，经水解、红外光谱、质谱等方法鉴定为白头翁皂苷 B4［8］，
经 RP-HPLC测定、面积归一法计算纯度为96.3%，使用时以正常培养基溶解过滤即可;流式细胞凋亡试剂盒(江苏碧云天生物科技有限公司);Caspase 3检测试剂盒CaspACETMAssay System检测试剂盒(Promega);MTT、二甲亚砜(DMSO)、碘化吡啶(PI)和RNase A(Sigma);阳性对照用氟尿嘧啶注射液(上海旭东海普药业有
限公司，批号:090107);凋亡DNA片段化提取试剂盒(TaKaRa);其他试剂均为分析纯;Thermo Scientific MK3型酶标(Thermo Fisher);FACS Calibur 101流式细胞
仪及相应耗材均为BD产品。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养 HepG2细胞培养在添加10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI 1640培养基，培养箱5%CO2，温度37℃。

当细胞生长面积覆盖80%～90%时常规传代。

1.2.2 细胞毒性试验实验设四组，分别为实验组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，每组设复孔6个。

接种新鲜的HepG2细胞于96孔板，每孔10000个，空白对照组不接种细胞，边孔加入PBS平衡水蒸气，培养过夜。

24 h后按照设计的浓度加入白头翁皂苷B4，每个浓度设复孔6个。

阴性对照采用PBS，阳性对照使用氟尿嘧啶。

12 h后更换1次培养液，培养至预定时间后吸去培养基，每孔加
入180 μL常规培养基与20 μL 5 mg/mL MTT储存液，铝箔包裹培养箱孵育4 h，吸去上清液，每孔加200 μL DMSO，铝箔隔光水平震荡上震荡20 min，在酶标
仪570 nm波长处读出每孔吸光值D。

抑制率按［(D570试验组-D570空白对照组)/D570阴性对照组］×100%计算。

1.2.3 细胞周期分析 6孔板每孔接种50000细胞，培养过夜。

加入不同浓度的白
头翁皂苷B4，每12 h换液，培养36 h。

胰酶消化、收集细胞，600 r/min离心
5 min，除去上清，用0.2 mL PBS清洗细胞2次，彻底去除残存 PBS，逐滴加入冰块预冷的乙醇600 μL，冰上放置 30 min，离心，仔细去除乙醇，用0.2 mL PBS清洗细胞 2次，用50 μL 10 mg/mL RNase A重悬，室温放置1 h，离心，加入150 μL PBS和200 μL PI染色液，立即上流式细胞仪分析。

试验重复一次。

1.2.4 早期细胞凋亡分析收集细胞方法同上，按照试剂盒推荐方法处理细胞，立即上机分析。

试验重复一次。

1.2.5 DNA片段化分析取接种24 h的10 cm平皿，分别用40 mg/mL白头翁皂苷B4处理预定的时间，按照试剂盒说明书操作提取细胞 DNA，与2×上样缓冲液1∶1混匀，点样，1.5%琼脂糖胶36 V电泳4 h。

1.2.6 Caspase 3活性测定采用Thornberry NA的比色法［9］测定Caspase 3
的活性。

直径10 cm培养皿接种400000细胞，培养过夜，加入含有不同浓度白
头翁皂苷B4的培养基继续培养36 h，胰酶消化收集细胞，调整各组细胞为
1×106个，PBS洗1次，重悬在预冷的1 mL裂解缓冲液中，-70℃冷冻30 min
后直接放入37℃水浴10 min，重复1次，冰上放置15 min，于4℃ 12000×g
离心30 min，移取上清待用。

取一块96孔板，每个样品设3个复孔，每孔加入32 μL反应缓冲液，2 μL DMSO 和10 μL 100 mmol/L二硫苏糖醇，测试孔加入20 μL细胞提取液，对照组加入20 μL正常细胞的提取液，空白组加入20 μL PBS，去离子水补足98 μL，最后向每个孔内加入2 μL 10 mmol/L DEVD-pNA储液，
混匀，密封，37℃孵育4 h后，酶标仪于405 nm波长处测定吸光度。

1.3 统计学方法
采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 白头翁皂苷B4抑制HepG2细胞增殖
分别采用0、5、15、45和135 mg/L的白头翁皂苷B4 孵育 HepG2 细胞 0、12、24、36 和 48 h，用 MTT 法测定细胞活性，计算细胞抑制率，结果显示:细胞抑制率随药物浓度增大、孵育时间增长而增大，具有明显的时效和量效关系。

在135 mg/L的药物作用48 h后，细胞抑制率达到71.5%(图1)。

经计算白头翁皂苷B4
对HepG2细胞的36 h半数抑制逍度(IC50)为38.6 mg/L。

2.2 白头翁皂苷B4对HepG2细胞周期调控的影响
分别采用0、5、10、20、40 和80 mg/L 的白头翁皂苷B4处理细胞36 h，经流式细胞仪分析各周期细胞的比例，结果发现:随着药物浓度的提高，G2期细胞比例大幅升高，从正常细胞的11.8%增长到83.2%，而同时G1或S期细胞比例均不
同程度下降，分别由正常细胞的54.4%下降到2.7%以及33.8%下降到14.1%。

由图2、3可见，多数细胞分布在S或G2期，特别是G2期而不能通过M期进入G1/G0期。

图1 白头翁皂苷B4对HepG2作用的量效、时效曲线Fig 1 Dose effect and time effect of pulchinenoside B4 on HepG2 cells
图2 HepG2细胞各周期分布流式细胞分析直方图Fig 2 Histogram of flow cytometry for cell cycle analysis of HepG2 cellsA～F分别为0、5、10、20、40和80 mg/L白头翁皂苷B4处理36 h后的流式细胞图。

2.3 白头翁皂苷B4导致HepG2细胞凋亡
鉴于白头翁皂苷B4对HepG2细胞周期的强烈抑制，同时我们也发现在其流式图中S1期(图2)细胞前面有一部分细胞有凋亡的迹象，因为其DNA含量降低，推断这部分不完整细胞可能含有发生了DNA程序降解的凋亡细胞，所以对其进行了细胞凋亡的分析。

采用40 mg/L的白头翁皂苷 B4孵育细胞，0、12、24和36 h后收集细胞，上流式细胞仪检测。

由图4可见，随着药物作用时间的增长，初期凋亡细胞，也即能被Annexin-V-FITC染色而同时不被PI染色的细胞比例先升高后降低，正常的凋亡细胞几乎为零，经40 mg/mL白头翁皂苷B4处理12、24、36 h后早期凋亡细胞比例分别上升到11.7%、14.3%和12.2%(图4)。

需要注意的是有很大一部分细胞并不能被Annexin染色，但是被PI染色，说明细胞没有经历早期凋亡的阶段而死亡，提示可能是坏死。

2.4 白头翁皂苷B4诱导HepG2细胞DNA片断化
凋亡细胞内激活的内源性钙镁离子依赖性核酸内切酶选择性降解染色体核小体间的DNA，导致细胞DNA广泛断裂形成大小不一的DNA片断在琼脂糖电泳上呈现规则的、间隔180～200 bp的梯状DNA区带，即DNA ladder［10］。

这些小的
DNA片断可能会通过细胞膜而被丢失，这会表现在流式细胞分析上DNA含量的
减少。

由此可见，图2中很多细胞DNA含量的降低可能与凋亡的细胞形成DNA ladder有关。

经40 mg/L白头翁皂苷B4处理0、12和24 h的HepG2细胞，经过 DNA抽提、1.5%琼脂糖电泳分析，结果发现未被处理过的细胞基因组比较完整，条带较集中，而经过白头翁皂苷B4处理过的细胞DNA较弥散，出现了小分子量DNA，形成
了典型的DNA ladder(图5)。

结果印证了上面的假设。

图3 经药物处理后各周期细胞分布变化趋势Fig 3 Changes of cell cycle distribution after treatment with pulchinenoside B4
图4 经药物处理后细胞早期凋亡细胞流式细胞仪分析图Fig 4 Flow cytometry of apoptosis of HepG2 cells after treatment with pulchinenoside B4A～D为
40 mg/L白头翁皂苷B4处理0、12、24和36 h后的流式细胞仪分析结果。

事实上，经过白头翁皂苷B4孵育的HepG2细胞从形态上的确呈现出了细胞连接
消失，细胞质密度增加，形成泡状结构，细胞变圆、缩小，与相邻正常细胞脱离，出现凋亡小体等凋亡细胞的典型形态［11］。

从以上结果可以看出，白头翁皂苷
B4确实可以诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡。

2.5 白头翁皂苷B4诱导Caspase 3活性升高
分别采用0、5、10、20、40 和80 mg/L 的白头翁皂苷B4处理细胞36 h后，
测得的细胞Caspase 3活性在白头翁皂苷B4＞5 mg/L白头翁皂苷处理组与对照
组均有显著性增高(图6)。

Caspase 3活性随着药物浓度增加呈先升高后下降的趋势，原因可能是随着药物浓度的增高，细胞由于凋亡数量减少，影响了Caspase
3的表达。

3 讨论
经白头翁皂苷B4处理的HepG2细胞，G1期细胞逐渐减少，而S、G2期细胞逐
渐增多，说明细胞在合成DNA后不能进行正常的细胞分裂。

白头翁皂苷B4很有
可能阻碍了细胞周期蛋白及其激酶，特别是让细胞正常通过G2/M检查点的cyclinA、B和CDK1的正常功能。

细胞死亡主要有凋亡和坏死，两者之间主要的区别是死亡过程中细胞本身是否主动参与［12］。

Caspase 3是真核细胞中最常见的凋亡蛋白，也是研究最为透彻的
半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，大多数的细胞凋亡与其有关［13］。

本研究表明，HepG2细胞在白头翁皂苷B4的作用下，由于不能进行正常细胞周期各时相更替，通过一种未知的机制使胞内Caspase 3表达量提高，从而使细胞进入凋亡程序。

有人曾提出假设解释这种机制，认为与泛素的合成及降解有关［14］。

本研究的流式细胞实验中很多迹象显示，在HepG2细胞经白头翁皂苷B4处理后，有一部分细胞并不是凋亡细胞，无论是白头翁皂苷B4的直接作用还是间接作用结果，都说明诱导凋亡并不是其抑制细胞增殖的唯一机制。

本研究只在体外对白头翁皂苷B4对人肝癌细胞的抑制作用进行了评价，有待体内证据的进一步论证;另外，体外实验中，白头翁皂苷B4对HepG2的IC50为38.6 mg/L，达到同样效果，5-FU只需3.5 mg/L，而折合摩尔浓度分别为31.6
μmol/L，氟尿嘧啶为26.9 μmol/L，白头翁皂苷B4比氟尿嘧啶浓度稍大，鉴于此，单独采用白头翁皂苷B4治疗肝癌具有一定的临床价值，联合化疗或辅助治疗也可能是白头翁皂苷B4在临床上应用的可能途径。

综上所述，白头翁皂苷B4在体外能够通过细胞周期G2/M阻滞抑制HepG2细胞增殖，并且可能因调高其Caspase 3表达而诱导其发生凋亡，为白头翁药材用于
治疗肝癌奠定了理论基础。

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