辣根过氧化物酶标记.ppt
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酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
◆ (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
•
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，
置4℃1小时。
• (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半 饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
• 少量0.15M PH7.4的PBS中。
•
(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M
PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用
• 萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀， 上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保
◆ 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大， 而且
◆ 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：
OPD
◆ (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝 绿
◆ 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比 前
4
• IgG量
40,000
160,000
17
注意事项
（1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中 9的抗体含量。
（2）碘酸钠要新鲜配制。 （3.） 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃
为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏 液
18
注意事项
• （4） 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也 要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保 证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
◆ 择)。
16
(2) 定量和克分子比值测定：
•
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定
(光程1cm)。
•
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
•
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-
OD403nm×0.42)×0.94×0.62
• 酶量
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml)
•
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── ×
酶标记抗体的制备方法主要有两种即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法这种方法法只适用于含分子表面的多?氧化为醛基醛基与抗4或乙醇胺或乙醇胺443在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体
辣根过氧化物酶标记
实验原理
（1）免疫标记技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性
戊二醛二步法
• 1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛 基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共
• 价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
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2. 标记步骤：
◆ (1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中， 于室温静置过夜。
◆ (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析 柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
• （5）所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用 试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用 戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体( 杂质)。否则，影响标记效果。
• （6）浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃ 下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数 周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
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• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯 酶容
• 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的பைடு நூலகம்蛋白 和棕
• 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等
◆
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
◆
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物
为
◆ 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)
早
◆ 期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻 联
• 存。
15
3. 结果判定：
◆ (1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗 体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作
◆ 双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后 用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其 活性。
◆ 最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里) 对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度 的选
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢 体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
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（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗 二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲 盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
◆ 钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG 浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
◆ 拌。 ◆ (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀
释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 ◆ (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续
搅拌3?小时。
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• (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小 时。
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
• 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表 示酶活
• 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
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◆ HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型
◆ 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
◆
HRP
的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
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（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
• 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于 水和
• 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和 275nm，一
• 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的 酶RZ值应
◆ 者可高4倍以上。
10
• 另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3乙基苯并噻吡咯啉-6磺
• 酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均 好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
• ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
•
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，
因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应
• 控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２ O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间
• 也不会增加反应产物的颜色。
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HRP标记抗体的方法
◆ 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结 构不同可采用不同的方法。对于制备HRP 结
◆ 合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。 尤以简易过碘酸钠法更为常用。
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谢谢观看
王伟航 学号： 83100232
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酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
◆ (AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、 溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
•
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，
置4℃1小时。
• (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半 饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
• 少量0.15M PH7.4的PBS中。
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(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M
PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用
• 萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀， 上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保
◆ 甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大， 而且
◆ 由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：
OPD
◆ (邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝 绿
◆ 色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比 前
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• IgG量
40,000
160,000
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注意事项
（1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中 9的抗体含量。
（2）碘酸钠要新鲜配制。 （3.） 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃
为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏 液
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注意事项
• （4） 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也 要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保 证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
◆ 择)。
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(2) 定量和克分子比值测定：
•
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定
(光程1cm)。
•
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
•
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-
OD403nm×0.42)×0.94×0.62
• 酶量
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml)
•
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── ×
酶标记抗体的制备方法主要有两种即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法这种方法法只适用于含分子表面的多?氧化为醛基醛基与抗4或乙醇胺或乙醇胺443在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体
辣根过氧化物酶标记
实验原理
（1）免疫标记技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性
戊二醛二步法
• 1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛 基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共
• 价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
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2. 标记步骤：
◆ (1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中， 于室温静置过夜。
◆ (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析 柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
• （5）所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用 试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用 戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体( 杂质)。否则，影响标记效果。
• （6）浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃ 下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数 周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
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• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯 酶容
• 易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的பைடு நூலகம்蛋白 和棕
• 色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等
◆
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
◆
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物
为
◆ 不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)
早
◆ 期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻 联
• 存。
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3. 结果判定：
◆ (1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗 体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作
◆ 双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后 用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其 活性。
◆ 最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里) 对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度 的选
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢 体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
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（5）加0.2 mL 新配的5 mg/mL NaBH４液，混匀，再置4 ℃, 2h。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃ 1h。 （7）3000 r/min 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗 二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/L pH7.4 的PBS中。 （8） 将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲 盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min 去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
◆ 钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG 浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
◆ 拌。 ◆ (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀
释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 ◆ (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续
搅拌3?小时。
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• (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小 时。
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
• 在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表 示酶活
• 性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
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◆ HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型
◆ 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
◆
HRP
的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标 记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的 性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性 核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称 为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化 学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
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（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
• 电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于 水和
• 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和 275nm，一
• 般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的 酶RZ值应
◆ 者可高4倍以上。
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• 另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3乙基苯并噻吡咯啉-6磺
• 酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均 好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
• ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
•
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，
因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应
• 控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２ O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间
• 也不会增加反应产物的颜色。
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HRP标记抗体的方法
◆ 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结 构不同可采用不同的方法。对于制备HRP 结
◆ 合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。 尤以简易过碘酸钠法更为常用。
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王伟航 学号： 83100232
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