中药指纹图谱的分类和发展

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———中药现代代化,2001,3∶12-15.
(收稿日期:2001-10-29)
中药指纹图谱的分类和发展
罗国安,王义明
(清华大学药物研究所,北京100084)
[摘要]　中药指纹图谱是中药现代化关键问题之一。

中药指纹图谱不仅是一种中药质量控制模式和技术,更是一种进行中药理论研究和新药开发的模式和方法。

中药指纹图谱应具有特征性,重现性和可操作性。

其发展应分为2个阶段:初级阶段和高级阶段。

初级阶段应解决指纹图谱的建立方法和相似度判定。

高级阶段应实现指纹图谱特征和药效相关性研究,即指纹图谱的生物等效性研究。

[关键词]　中药指纹图谱;分类;发展
[中图分类号]R28 [文献标识码]A [文章编号]1003-3734(2002)01-0046-06
Classif ication and Development of TCM Fingerprint
L UO Guo2an,WAN G Y i2ming
(Medici nal Instit ute of Tsi nghua U niversity,Beiji ng100084,Chi na)
[Abstract]　The TCM fingerprint is one of the strategic subjects for TCM modernization.It is not only a mode and technique for TCM quality control,but also a research mode and strategy for TCM theories and new drugs development.The TCM fingerprint need to have stable characteristics, reproducibility and operability.The development of TCM fingerprint consists of two stages:the pri2 mary stage and the superior stage.The target of the primary stage is to develop an strategy for estab2 lishing a fingerprint and evaluate the conformability.The target of the superior stage is to study the correlation between characteristic of TCM fingerprint and the pharmacodynamics,that is a research on the biological equivalence of TCM fingerprint.
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[K ey w ords]　TCM;classification;development
中医药作为中华民族科学、文化和历史的伟大宝库,是我国在自然科学领域最有优势、最有特色、最有希望的学科之一。

中药产业也应是我国国民经济中新的经济增长点。

随着21世纪的到来和我国即将加入WTO,国际医药产业竞争日益激烈。

国际经济一体化对传统中药产业提出了现代化、国际化的要求,我国中药产业面临严峻挑战。

近年来,我国中药(包括中药材)出口总量不但没有增加,反而呈现减少的势头以及“洋中药”进口的大幅度增加,给我们带来了危机感和紧迫感。

中药作为中国的国粹如果不能以其现代化的面貌服务于全人类,必将会影响中国的新药开发研究和发展,最终会影响中国中药大国的地位。

中国新药研究与开发协调领导小组于1996年提出了“中药现代化科技产业行动计划”,旨在运用现代科学的理论和手段,促进中医药这个最具有我国文化特点的学科和产业走向现代、走向世界,并于1998年出版了《中药现代化发展战略》一书[1]。

自此以后,我国中药现代化已有快步发展,中药行业的GMP,G AP等均在不断实施,可以说中药现代化已经历了2个阶段。

第一阶段(即第一波攻势)是自1996～2000年即九五期间,主要是由国家科技部、中医药管理局和国家自然科学基金委等部门主持和资助,以科研院校为先锋和主体,中药企业积极参与的中药现代化行动。

在此期间,提出了很多实现中药现代化的理论和学说,对许多课题开展研究,其标志是国家重大基础研究计划(973计划)中首次列入有关中药方面的课题“中药方剂关键科学问题研究”。

同时有关部委也制订了G MP,G AP等各种规范,推广试行。

第二阶段(第二波攻势)是在第一阶段基础上,更多的部委推动中药现代化,尤其是国家计委、经贸委等提出的“国家现代化中药产业化专项项目”等,以更大的投入推动现代中药产业化,逐步实现以企业为主体,科研院校积极参与的现代中药产业化和国际化。

在2个阶段的接替之际,由国家药品监督管理局(SDA)倡导的中药指纹图谱[2]抓住了中药现代化的关键问题之一,对推动中药现代化、产业化和国际化具有重大作用。

在中药现代化过程中,采用中药指纹图谱的意义,正如SDA 任德权副局长所指出的:“已是牵动行业全面进步的关键技术,其应用研究,对保证中成药功效,提高中药工业整体水平,带动中药农业现代化,推进中药走向世界,具有非常重要的现实意义”[3]。

本文从中药指纹图谱的分类和发展来阐述中药指纹图谱的作用。

1　中药指纹图谱的概念和分类
“指纹”(fingerprint)鉴定来源于法医学,每个人的指纹在微小的细节构造中各有不同。

依据这些差异,通过“比对”方式,可以确定鉴别每个人的特征。

每个人都有指纹,如何在基本指纹模式(共性)中确认犯罪嫌疑人的特征指纹(唯一的个性)是法医学的要求,即其指纹分析强调的是个体的“绝对唯一性(absolute uniqueness)”或“个性(individuality)”。

随着生物技术的发展,提出了DNA指纹图谱分析,主要是通过DNA指纹图谱,对人、动物、植物等生命体进行鉴别鉴定,乃至亲子鉴定等,扩大了指纹分析的含义,其意义主要表现在2个方面:一是成为指纹图谱。

指纹是以图像形式表现,而DNA指纹图谱是一些DNA片段所构成的条带图谱;二是分析目的有所扩展,既可以象指纹分析一样作个体“唯一性”的鉴定,又可以鉴别确定整个物种的“唯一性”(多个个体之间的共性),还可以用作亲子鉴定,即判断个体之间的亲缘关系等。

中药指纹图谱则和DNA指纹图谱又有所不同。

1.1　中药指纹图谱的概念　中药指纹图谱(finger2 printing)借用DNA指纹图谱发展而来。

最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱,特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。

HPLC具有很高的分离度,可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图,这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量。

整个色谱图表征了该样品所含化学成分的多少和量的大小。

银杏提取物的HPLC指纹图谱中共有33个峰,这些峰的高度和峰面积的大小则表征了各个化学成分的量。

由此可见,中药指纹图谱比DNA指纹图谱更进一步的发展在于:不但有特征的体现(各种化学成分的个数和相对位置———保留时间)可作定性鉴别使用,还体现了量的概念。

峰的高度和峰面积表征了某个化学成分的含量,而各峰的峰高(或峰面积)的比值体现了各种化学成分间的相对含量。

量的概念的引入,定性和定量的结合赋予中药指纹图谱更大的功效。

中药指纹图谱不仅可以进行个体、某物种的“唯一性”的鉴定,还可以将其“量”的特征和其他体系挂钩,例如和药效研究结果挂钩。

银杏提取物的指纹图谱体现了其所含33个银杏黄酮(化学成分)和各自含量。

德国经30多年的化学成分和药效相关研究,发
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现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的银杏提取物(有相应的指纹图谱控制其成分和相对含量)具有最好的疗效就是一典型范例。

因此,中药指纹图谱不仅是一种中药质量控制模式和技术,更可以发展成为一种采用各种指纹图谱来进行中药理论(复杂系统)和新药开发的研究体系和研究模式[7]。

1.2　中药指纹图谱的分类　狭义的中药指纹图谱是指中药化学(成分)指纹图谱。

广义的中药指纹图谱则可按应用对象、测定手段进行不同的分类。

1.2.1　按应用对象分类　中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段,按应用对象来分类,可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。

如分得更细,还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。

中药材指纹图谱按测定手段又可分为中药材化学(成分)指纹图谱和中药材DNA指纹图谱。

中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱,由于每个物种基因的唯一性和遗传性,中药材DNA 指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。

它对中药材G AP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。

中药材化学(成分)指纹图谱是指测定中药材所含各种化学成分(次生代谢产物),所建立的指纹图谱。

虽然化学成分是次生代谢产物,受生物环境和生长年限的影响而产生个体间较为明显的差异,但植物的代谢具有遗传性,作为同一物种的个体在化学成分上也具有相似性(similarity),可以用化学成分的谱图来建立指纹图谱。

中药材化学指纹图谱对控制中药材质量具有更直接、更重要的意义。

建立中药材化学指纹图谱须考虑诸多方面的影响。

中药品种混杂,历史上形成的同名异物带来很多困扰。

如中药贯众原植物涉及5科25种以上。

同一物种内因受产地环境影响,某些有效成分含量相差很大。

不同品种所含成分不稳定的程度各不相同,有的品种成分组成波动较大,再加上各种不同中药制剂有可能是使用了某种药材的不同的有效部位。

因此对某种中药材采用统一的指纹图谱在现阶段还缺乏必要的数据积累来制订合理的相似性的标准。

可以在实施中药材G AP基地过程中,制订较为宽松要求的指纹图谱,逐步积累数据再行判定。

对于不能栽培的中药材,指纹图谱的相似度理应更宽。

中药原料药指纹图谱应区别对待。

对中药饮片指纹图谱的要求基本和中药材指纹图谱相同。

对中药配伍颗粒(包括标准提取物)指纹图谱应要求高一点。

应鼓励生产厂家采用标准提取工艺,严格控制操作参数,并对原药材采取“混批勾兑”的做法,完全可以建立较稳定的指纹图谱进行质量控制。

建立稳定的中药制剂化学指纹图谱,如能实现将原药材投料改为提取物投料(可用混批勾兑做法),严格控制工艺流程,对生产工艺实现全过程指纹图谱监控,必定可以解决最终产品的质量稳定问题。

1.2.2　按测定手段分类　中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。

中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。

光谱最常用的是红外光谱(IR)。

色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。

其他方法包括波谱[质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)]和联用技术[6,8,9,15]。

中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。

TLC法简便易行,但提供信息量有限,很难反映几十种、上百种化学成分组成的复杂体系。

GC适用于挥发性化学成分。

HPLC适用于非挥发性成分,中药中大部分化学成分均可用HPLC法得出良好的指纹图谱。

CE适用于大部分化学成分,特别是生物大分子———肽和蛋白的分离,但其重现性有待提高。

联用技术是最有效的建立指纹图谱的方法,如GC/MS,HPLC/MS,HPLC/MS/MS等可提供大量各种信息,符合解决中药复杂体系的要求,但仪器价格昂贵,不易推广使用。

总之,目前使用最多的中药化学指纹图谱是用HPLC方法。

中药生物指纹图谱包括中药材DNA指纹图谱和研究中的中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱。

中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药制剂作用于某特定细胞或动物后,引起的基因和蛋白的复杂的变化情况,这2种指纹图谱似可称为生物活性指纹图谱。

目前而言,最主要和常用的是中药化学指纹图谱,特别是中药HPLC指纹图谱。

2　中药指纹图谱的要求和发展阶段
中药指纹图谱可分为2个层次:一是中药质量控制的一种模式,二是中药理论(如方剂配伍、七情和合等)和新药开发(如药效成分群和药理药效相关性等)的一种研究体系和研究模式。

因此必须考虑中药指纹图谱的可行性、对它的要求和其发展阶段。

2.1　中药指纹图谱切实可行　中药材及中成药均
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含有大量各类化学成分,建立中药指纹图谱是否可行,即现在是否已具备足够的条件来大规模开展此项工作?其次,大规模开展中药指纹图谱建立工作应如何进行?这2个问题的答案都是肯定的。

建立中药指纹图谱已具备足够的条件,主要体现在已有长期、大量植物化学数据的积累,现代分析科学、信息科学和复杂性科学的快速发展。

我国已先后组织过多项重大课题对200多种常用单味中药的化学、药理、含量测定和质量标准等多方面进行了系统的整理和鉴定。

对黄芪、淫羊藿等上百种传统中药进行过化学成分的分析,发现了部分中药的有效成分。

20世纪90年代又对中药复方进行了各种层次、程度深浅不同的化学成分研究,目前已积累了大量的单味中药的化学成分数据和研究中药复方化学成分的研究思路和部分数据,这些积累是其他国家所缺乏的。

现代分析科学的迅速发展,为指纹图谱的建立提供了大量先进的方法学和稳定可靠的仪器和技术,尤其是联用技术的快速发展,使未知成分的在线解析提供了可能。

信息科学的发展可使所获得的大量数据实现信息化和知识化。

近年来出现的复杂性科学为我们针对中药这样一个复杂巨系统的解决提供了整体思路和相应的方法。

因此,大规模开展中药指纹图谱的研究已具备扎实基础。

2.2　中药指纹图谱的要求　中药指纹图谱应满足特征性、重现性和可操作性,才能满足指纹图谱的实用要求。

中药指纹图谱不论是中药材,还是中成药、中药方剂,一定要能体现该中药(药材或复方)的特征,也可称为专属性或唯一性。

当然也有可能用一张指纹图谱不足以表现其全部特征,而用几张指纹图谱来表现某种中药(药材或复方)的各个不同侧面的特征,从而构成其全貌。

但对其中的每一张图谱仍应有其特征性(专属性)的要求。

指纹图谱主要是用来表现、控制中药的化学成分群的整体,故要有较好的重现性,即同一样品,同一操作条件下,结果的重现性要好。

因此根据不同的要求要考虑选用何种分析方法建立指纹图谱最合适。

中药这样的复杂体系,基本特性之一是复杂性[4,5,10],其中包含了不确定度和一定的模糊性。

这些问题和重现性的概念不同,可以在指纹图谱的数据处理中(如相似度的判断)采用适当的方法予以解决。

指纹图谱的可操作性系指针对不同用途,选用不同分析方法来达到不同的要求。

如对于质量控制应考虑工厂和药检所常规配备的仪器设备来建立相应的方法,一般以光谱和气相色谱、高效液相色谱为主。

对于用指纹图谱来进行配伍理论或新药开发研究,特别是化学成分和药理、药效相关性研究,就应考虑采用联用技术,如G C/MS、HPLC/DAD/MS/MS等方法,获取大量信息,更有利于得到明确的结果。

即使对质量控制来说,对中间产品指纹图谱的要求,特别是相似度的判断上,要求就可比最终产品低一些。

2.3　中药指纹图谱的初级阶段和高级阶段　指纹图谱作为中药现代化的一个突破口,应不仅仅局限于中药质量标准的提高,而是应该站在如何使现代科学体系与传统中医药学有机结合,最终将中医药推向世界的高度去认识,以此作为一个契机,建立起完善的方法学,用现代各交叉学科的语言去阐述中医药的精髓,实现新的腾飞。

但指纹图谱的建立具有一定的阶段性,就目前而言,指纹图谱的系统研究尚处于起步阶段。

诚然,经过数十年的研究和发展,中药(中药材、饮片、中成药)得到了大量研究,对于其中的化学成分的分离和测定积累了大量数据,在一定程度上,为中药的整体性说明打下了较好的基础。

但是,即使从中药质量控制来说,仍未达到指纹性描述的作用,不能有效的反映和控制中药的整体质量,还需进一步深入探讨。

因此,中药指纹图谱的研究与建立应该分为2个阶段,即初级阶段和高级阶段。

初级阶段应是确立指纹图谱的建立方法及相似度判定。

中药注射剂起效快、疗效好,化学成分相对其他中药来说要少得多,但对其产品质量要求又比其他中药制剂更高。

选择中药注射剂,开展制订其指纹图谱工作,具有很强的可行性。

对中药注射剂而言,在初级阶段,通过对注射剂(最终产品)、中间产品及和工艺制备相关的原药材的指纹图谱研究,建立系统的测定方法和相应的指标控制参数,达到指纹图谱的可操作、可控、稳定和量化的目的。

利用指纹图谱表达成品的质量、实现对工艺操作和原药材的质控;也可利用指纹追根溯源来寻找工艺操作中的问题和实现对原药材G AP的质量要求。

取得大量指纹图谱数据后,就可讨论制订判别指纹图谱相似程度的方法和指标,可以采用“共有峰”的方式来判断相似程度从而达到控制目的,也可采用对指纹图谱整体进行“模式识别”来判断其相似程度,并确定各种控制参数。

初级阶段工作重心应放在对测定方法的建立,方法稳定性和适用性考查,化学有效部分基础研究,图谱多指标控制等,力求基本说清中药化学基础及质量控制参数,将中药质量控制提到整体量化的高度。

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在得到相对完备的中药指纹图谱后,应进入研究的高级阶段,即指纹图谱特征和药效相关性研究,指纹图谱的生物等效性研究。

多维多息特征谱或谱效学的基本含义即是如此。

西药是定量构效关系,即一定的分子结构有其相应的生物效应。

中药是起药效的化合物群在发挥作用,不同的配伍(包括药味和剂量的改变)将引起化合物群在包含化合物的种类和个数以及含量上发生改变。

这种群体的变化可通过指纹图谱这种形式表达。

指纹图谱所体现的化学成分的变化(种类、个数和含量)和药效的变化(药效实验或临床效果)建立数量相关性,此时所得的指纹图谱不再是化学成分的整体表达,而且包含了与此相关的药效生物信息,即控制某张指纹图谱就可达到体现相应的药效和临床效果。

如左金丸是由黄连和吴茱萸按6∶1的比例制成,主治胃热呕恶,口苦苔黄等症。

反左金则由黄连和吴茱萸按1∶6的比例制成,主治胃寒等症。

2个方剂所含药味相同,比例不同,在指纹图谱上能反映出其整体化学特征的差异,这些化学成分的变化量和药效、临床效果变化量的关系就能体现出每个指纹图谱所代表的药效信息。

不同的药味,指纹图谱变化就更大,对应的药效也不同。

改变配伍,进行化学成分和药效信息定量相关研究,就可用不同的指纹图谱来体现不同的生物信息。

新药开发研究如能从一开始就采用指纹图谱来体现化学成分群的变化,结合进行药理、药效实验,进行相关性分析,势必事半功倍,加快新药开发速度,并达到较高水平。

初级阶段和高级阶段没有截然的分界线。

在初级阶段主要是能进行较全面的质量控制,所以研究应该深入,但到具体工厂实施时,则应相对简化,以利于工厂实际推广需要。

初级阶段积累的数据也能为高级阶段提供基础。

达到能体现化学和药效相关综合信息的指纹图谱必定能为中药走向世界主流医药市场提供可靠的质量保证。

2.4　指纹图谱信息化和知识化
2.4.1　指纹图谱信息化　指纹图谱信息化包括数据的获取和数字化。

主要过程为针对某类样品和要求,确定合适的获得指纹图谱的分析方法(如色谱或光谱等),建立整个分析方法的各种操作条件,进行测试,以获得不同样品的指纹图谱,即数据的获取。

对所得指纹图谱进行分析,确定其数字特征。

如对红外指纹图谱,可用峰的波数和强度作为其数字特征来表示某个峰。

对于高效液相色谱,峰的参数可选用保留时间(或相对保留时间)、峰高(或/和峰面积)作为数字特征。

实测的指纹图谱直观,在简单的情况下容易比较各指纹图谱的差异,将指纹图谱按数字特征抽提而得到的数字化指纹图谱则易于大量贮存和比较、利用。

对大量的指纹图谱应该建立数据库。

对于中药材,应建立不同品种、不同产地、不同采收期和炮制方法所得指纹图谱数据库,以便于比较、确定其间差异。

对于中药制剂(中成药),除了中药材的指纹图谱库外,还应建立原药材、中间体或有效部位、最终产品的全过程指纹图谱库,便于实现全过程质量控制,追踪确定工艺操作条件和原药材变化对产品质量的影响。

对于新药研究与开发,可对每步研究样品建立和药效相关的指纹图谱,汇集成数据库,即可监测、表征各有效部分的化学和药效信息。

在这些数据库结构中,增加用以判断、比较各指纹图谱相似度的方法和功能,即成为智能数据库,可对新输入的样品指纹图谱和原有的指纹图谱进行比对,从而对新输入的指纹图谱进行判读,确定其质量等。

2.4.2　指纹图谱知识化　获得信息化后的指纹图谱后,需要研究如何来利用这些信息,即实现指纹图谱知识化。

指纹图谱知识化包括信息解读、比较和判断,化学信息和药效信息相关性研究和信息的利用,即从大量指纹图谱数据中得到有关规律和知识。

毕开顺等[12]对黄芪所作研究工作就是1例。

对黄芪所含化学成分分离提取,得到黄酮类、皂苷类、氨基酸类、多糖类和其他类5部分。

在中医药理论指导下,采用抗炎实验、抗疲劳实验和补气实验所获得的药理数据和化学数据进行逐步回归分析和典型相关分析,确定黄芪中黄酮类、皂苷类和氨基酸类为其产生功效的主要物质基础。

选择黄酮类和皂苷类作研究对象,将30个正品和1个伪品黄芪药材经预处理后,分取样品溶液的乙酸乙酯层和正丁醇层,作了黄酮类和皂苷类成分HPLC指纹图谱,得22个色谱峰,作为化学特征变量,选用毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷作参照物。

指纹图谱数字化后,进行系统聚类分析。

31个样品可分为3类(较好、一般、较差),发现蒙古黄芪和膜荚黄芪为质优正品黄芪,与传统生药学鉴定和药理评价结果完全一致。

除可区别正品、非正品和伪品黄芪外,还可对未知样品黄芪质量进行预测。

对中药制剂也可进行类似工作[7],即根据该方剂已知的疗效,确定相应的药效实验方法,根据组成中成药的各味药材(或有效部分和成分)的现有化学和药理资料,结合工艺确定可能存在的化学成分类别,采用现代分离手段(如超临界萃取、大孔树脂吸附分离、逆流色谱及各种制备色谱)将
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