长毛兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定

长毛兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定
赵蕾;李坤林;李书光;孙翠平;宋峰;沈志强
【摘要】从内蒙古包头市某养殖场患有肺炎的病兔分离到一株革兰氏阳性球菌,通过形态学观察和生化试验进行了初步鉴定,并通过16S rRNA序列扩增和测序进行分析,BLAST分析结果显示,该菌与金黄色葡萄球菌的核酸序列同源性达99.6％,确定该分离菌株为兔金黄色葡萄球菌,并将其命名为BTSH1.%A gram-positive cocci was collected from pneumonia illness rabbit in a farm of Baotou. Morphological observation and biochemical tests methods were taken for identification. Furthermore, 16S rRNA PCR amplification and sequence a-nalysis were processed, and BLAST analysis showed the nucleic acids allogenic to Staphylococcus aureus sequences reach 99, 6%. The results displayed this separation strain was a Staphylococcus aureus, and it was named BTSH1.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2011(038)009
【总页数】3页(P184-186)
【关键词】兔金黄色葡萄球菌;分离;鉴定
【作者】赵蕾;李坤林;李书光;孙翠平;宋峰;沈志强
【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州
256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州 256600
【正文语种】中文
【中图分类】S852.61+1
兔葡萄球菌病是由金黄色葡萄球菌引起的家兔的一种常见病，以败血症或各种器官的化脓性炎症为特征（王云峰等，1997；黄晓红，2005）。

临床表现为消瘦、精神沉郁，伴有腹泻。

不分性别、年龄、品种，兔对该病均易感，一年四季均可发生，尤以气候温暖和潮湿季节多发（Franklin等，1998；Silvija等，1998）。

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，菌体较大，常呈葡萄状，有时呈双球或短链状排列。

2010年11月2日，内蒙古包头市某小型养殖场养殖的300只长毛兔开始发病，11月4日，已经死亡46只，有近50只长毛兔精神沉郁，眼红流泪，流鼻涕，拉稀粪，有的带黏液并污染后肢及肛门，在头、颈、背、腿等部位个别有肿块，剖检发现病兔肝脏、脾脏、特别是肺脏红肿、硬结，脓肿小如豌豆，数目不一，有的肺脏和气管出血，胆囊肿大。

采集病兔肝脏、脾脏和肺脏组织，用密封病料盒包装带回实验室，由实验人员分离鉴定到了一株兔金黄色葡萄球菌。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源内蒙古包头市某养殖场出现兔球菌病特征性病变的长毛兔肝脏、脾脏和肺脏组织作为被检材料。

1.1.2 试验动物 1.5～
2.0kg兔由绿都生物科技有限公司实验动物中心提供。

1.1.3 试剂染色液及培养基由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技
术重点开放实验室配制保存；各类生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司；限制性内切酶、DL2000、Taq酶、pMD18－T载体、EcoRⅠ和SalⅠ酶，均购自TaKa－Ra公司。

细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.1.4 引物根据GenBank已发表的葡萄球菌的16SrRNA序列，设计1对引物，
预期扩增片段长度为1505bp，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

引物序列如下：P1：5′－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3′，P2：5′－TACGGYTACCTTGTTACGACT－3′。

1.2 方法
1.2.1 直接镜检按常规方法进行，将上述病料直接涂片，进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 分离及培养特性将上述病料斜面接种普通琼脂平板和血琼脂平板，37℃厌
氧和有氧条件下分别培养24h，进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态及染色特性，选取疑似菌落进行划线纯培养。

挑取纯培养的单个菌落接种在普通营养肉汤培养基中，37℃培养24h。

1.2.3 生化鉴定按照常规方法进行生化鉴定。

1.2.4 家兔回归试验取健康家兔6只，其中4只静脉注射24h细菌液体培养物
0.5mL／只（108 CCU／mL），另外2只作为对照，静脉注射生理盐水0.5mL／只，对死亡家兔进行细菌分离鉴定。

1.2.5 细菌基因组DNA的提取参照试剂盒说明书进行。

1.2.6 16SRNA的扩增及序列分析以CTAB法提取该株细菌的基因组DNA，进行PCR扩增；阴性对照以纯水代替细菌基因组DNA。

PCR产物经胶回收纯化后与pMD18－T载体连接，转化至DH5α，酶切鉴定的阳性克隆株送上海生工生物工
程有限公司进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST分析。

2 结果
2.1 镜检病料直接涂片镜检可见到均匀一致多以成对排列的革兰氏阳性球菌，圆
形或卵圆形葡萄状和短链状的球菌。

也可见单个或不规则葡萄串状排列。

2.2 培养特性从肝脏、肺脏和脾脏病料中都分离到了细菌，均在普通琼脂平板和
血琼脂平板生长为圆形、稍隆起、边缘整齐、表面光滑的中等大小菌落，菌落直径约3mm，血琼脂平板上有溶血现象。

取菌落涂片，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阳性的单在或成双、多以成双排列的球菌（图1）。

在普通营养肉汤培养基中迅速生长，呈均匀混浊、有菌环，瓶底有少量灰白色沉淀物，上述培养基生长的细菌形态特性与病料直接镜检结果基本相似，将分离菌株暂命名为BTSH1。

2.3 生化鉴定将BTSH1菌株纯培养物接种于生化反应管中，根据说明书要求的不同时间观察并记录，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、果糖、木糖、阿拉伯糖，不发酵甘露醇，不产生硫化氢和靛基质，不能利用枸橼酸盐，甲基红试验阳性，VP试验阳性，凝固酶试验阳性，经鉴定完全符合金黄色葡萄球菌的特性（表1）。

图1 镜检图片（革兰氏染色，1000×）
表1 分离菌的生化鉴定结果注：“＋”表示该生化试验结果阳性；“－”表示该
生化试验结果阴性。

枸橼酸盐利用试验生化H2S凝固酶试验Pm－项目葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖甘露糖果糖木糖阿拉伯糖厌氧甘露醇试验靛基质试验甲基红试
验VP试验HN＋＋＋＋＋＋＋＋＋－－－＋＋＋
2.4 家兔回归试验攻毒组2d后，出现肺炎症状后死亡，对照组观察一周全部健活，死亡兔剖检可见肺脏出血，胃、心脏、心肌及其他脏器组织有大小不一的脓肿病变与自然病例相似，取肺脏病灶部材料培养分离经鉴定与接种菌一致。

2.5 16SrRNA的扩增及序列分析对提取的细菌DNA进行16SrRNA序列的PCR
扩增，获得了与预期片段大小相符的扩增条带（1505bp），而阴性对照未扩增出目的条带（图2）。

将所得到的序列与GenBank中FJ899095.1金黄色葡萄球菌
株16SrRNA序列进行比对，其中第33位、462位、508位、1438位发生突变，同源性达到99.6%。

图2 PCR扩增注：M，DNA Marker DL2000；1，空白对照；2，样品1；3，样品2。

3 讨论与小结
细菌的rRNA有23SrRNA、16SrRNA和5S rRNA。

16SrRNA序列含有进化速率不同的区域－可变区与恒定区，以及多个重复的核苷酸三联体序列；不同种属的细菌，其16SrRNA序列有差异。

根据这些特点，16SrRNA常被用于细菌种属的鉴
定和分类，该方法具有很高的敏感性和特异性，被国内外很多研究者应用于病原菌的同源性分析与鉴定（Soumitesh等，2007）。

经过流行病学、临床症状、剖检变化及对病兔脏器细菌的分离培养、生化试验、动物感染试验和16S rRNA的序列分析，确定该兔场流行的疾病是由金黄色葡萄球
菌感染所引起的。

葡萄球菌对麦芽糖和甘露醇的发酵因菌株不同而有差异，该株金黄色葡萄球菌能够发酵麦芽糖不发酵甘露醇。

葡萄球菌大多是呈不规则的葡萄串状或短链排列，有少数单在或成双排列，但这次分离到的球菌镜检多为成双排列，再加上病兔有肺炎症状并且剖检发现肺部病变比较严重，所以怀疑是兔肺炎双球菌感染，但最后经过16SrRNA的扩增及序列分析，确诊为金黄色葡萄球菌感染，所以针对如今病原感染所引起症状和病变的复杂性，对分离菌的分子生物学鉴定还是很有必要的。

最近有研究人员发现，金黄色葡萄球菌可以在72h之造成患者患肺炎死亡（Susan等，2007）。

由葡萄球菌引起的长毛兔肺炎症状临床上比较罕见，应引起养兔生产者和兽医工作者的高度重视。

金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界，养兔生产者应经常保持兔舍、兔笼的清洁卫生，做好定期消毒来预防本病。

同时应用金黄色葡萄球菌培养物制成的灭活菌苗，通过免疫接种，可起到较好的效果，但需要对本动物进行安全性和保护率的试验合格后
方可使用。

参考文献
1 王云峰，王翠兰.兔葡萄球菌感染的诊断［J］.中国畜禽传染病，1997，19（6）：51～53.
2 赵永达，黄显会.一例犬金黄色葡萄球菌病的诊断及药敏试验［J］.中国畜牧兽医，2010，37（9）：225～229.
3 黄晓红.兔葡萄球菌病的防治［J］.福建畜牧兽医，2005，27（2）：50.
4 Franklin D，Lowy M.Staphylococcus aureus infections［J］.Medical Progress，1998，339：520～525.
5 Silvija N C，William R S，et al.Staphylococcus aureus genetic loci impacting growth and survival in multiple infection environments
［J］.Molecular Microbiology，1998，30（2）：393～402.
6 Soumitesh C，Danica H，Michele B，et al.A detailed analysis of
16Sribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria［J］.Microbiol Methods，2007，69（2）：330～339.
7 Susan B V，Robert S munity－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus：the role of Panton－Valentine leukocidin
［J］.Laboratory Investigation，2007，87：3～9.。