乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)

乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法）

1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围: PCR实验室。

3.职责:

3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献:

4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》

4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书

5. 内容:

5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。

5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA.

5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.3.1 标本类型：血清。

5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。

5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。

5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。

5.4 设备和试剂:

5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

5.4.2 试剂：

5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒

5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100

μL/管）1管，溶液Ⅱ浓缩液（25ml/瓶）1瓶，溶液Ⅲ（1ml/管）2管，溶液Ⅳ（100μL/管）1管，杂交膜条（10人份/袋）1袋。

5.5.2.3 试剂包装规格：单管单人份，10人份/盒。

5.5.2.4 试剂保存和有效期：PCR试剂保存于-20±5℃，应避免反复冻融，反向点杂交试剂保存于2-8℃。试剂盒有效期为6个月。

5.6 操作过程:

5.6.1 血清标本的处理:

5.6.1.1 打开恒温水浴箱或干式恒温器，设定温度100℃。

5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、DNA浓缩液，让其在室温下完全融化。

5.6.1.3 取100ul DNA浓缩液，分别加到1.5ml的离心管中并编号。

5.6.1.5 往装有100ul DNA浓缩液的离心管中加入待测样本血清100μL，用振荡器振荡混匀5s。

5.6.1.6 12,000 rmp离心10min。

5.6.1.7 去上清液，沉淀中加入25μLDNA提取液，振荡器震荡均匀5-10s，100℃恒温处理10±1min。

5.6.1.8 12,000rpm离心5min,4℃保存备用（如需长期保存请放置-20℃）。

5.6.2 PCR扩增：

5.6.2.1 取反应管若干，并编号，加入处理好的样品上清液5μL，2,500rpm离心一分钟，放入仪器样品槽。

5.6.2.2 按下列条件扩增：

50℃→3min；93℃→5min；93℃ 30s→58℃ 40s→72℃ 45s→10个循环；93℃ 30s→56℃ 40s→72℃ 45s →10个循环93℃ 30s→55℃ 40s→72℃ 45s→25个循环最后72℃保温7min。

5.6.3 杂交：

5.6.3.1 杂交前准备：打开振荡水浴箱，调节温度至45℃，将杂交液Ⅰ和Ⅱ放入45℃水浴中溶解待用，准备好实验所需的15ml离心管若干个待用。

杂交前试剂配制：

杂交液Ⅰ：将杂交液Ⅰ浓缩液50℃水浴溶解，充分摇匀后用去离子水（浓缩液与去离子水体积比为1:4）稀释。室温储存，使用前充分溶解混匀。

杂交液Ⅱ：将杂交液Ⅱ浓缩液50℃水浴溶解，充分摇匀后用去离子水（浓缩液与去离子水体积比为1:4）稀释。室温储存，使用前充分溶解混匀。

溶液Ⅱ：将溶液Ⅱ浓缩液用去离子水稀释而成（溶液Ⅱ浓缩液与水体积比为1:4）

溶液Ⅳ：稀释而成，如：10μL+90μL去离子水

结合液现用现配（1人份）：100μL溶液Ⅰ+2mL充分溶解混匀的杂交液Ⅰ（按此比例配制，如10人份1000μL溶液Ⅰ+20mL充分溶解混匀的杂交液Ⅰ）

显色液现配现用（1人份）：1mL溶液Ⅱ+100μL溶液Ⅲ+0.5μL稀释10倍后的溶液Ⅳ×2（按此比例，根据具体情况配制）