蛋白质与酶工程复习资料
课程复习要点 for 本科生 酶工程与蛋白质工程
第六章 生物催化剂的修饰和改造
பைடு நூலகம்
第八章 生物反应器
• • • • • • • • 1、酶反应器和细胞反应器的异同点？ 2、生物反应器的分类 3、如何实现生物反应器的混合？方法有哪些？ 4、什么是全混流反应器和平推流反应器？ 5、BSTR搅拌器类型和特点？ 6、什么是PBR、FBR、MBR？ 7、选择酶反应器的依据有哪些？ 8、反应器放大的原则有哪些？
• • • • • • • • • • • 1、酶蛋白结构特征和氨基酸残基功能 2、酶蛋白分子水平改造方法有哪些？ 3、什么酶分子的大分子化学修饰和方法？ 4、什么酶分子的小分子化学修饰和方法？ 5、什么酶分子的物理修饰和方法？ 6、什么酶分子的化学修饰和方法？ 7、酶蛋白侧链基团修饰方法？ 8、什么酶的金属离子置换修饰？ 9、什么酶组成单位修饰和方法？ 10、定点突变和定向进化对酶蛋白的改造有什么区别？ 11、酶蛋白化学修饰的局限性？
课程复习要点
酶工程与蛋白质工程 邓利
题型
一．填空题：30分 二．判断题：10分 三．名词解释：20分 四．简答题：20分 五．设计题：20分
第二章 酶的来源和生产
• • • • • • • • • • • １酶的生产方法，微生物产酶的优点． ２酶生物合成的调节方式 ３什么是组成型酶和调节型酶． ４产酶微生物具备的基本条件，常见微生物及产酶举例 ５酶发酵的生产方式，产酶的一般工艺流程及控制参数． ６提高酶产量的措 ７酶生物合成的模式？影响合成模式的因素，理想的酶合 成模式是什么？ 8 Monod 方程和米式方程表达式和意义 ９固定化细胞和固定化原生质体产酶 １０固定化细胞产酶动力学方程式 11、酶活力和比活力？
蛋白质与酶工程--酶学基本理论
3、水解酶 （3） 4、裂合酶（4）
AB＋H2O＝AOH＋BH AB＝A＋B
5、异构酶 （5）
A＝B
6、连接酶或合成酶（6） A＋B＋ATP＝AB＋ADP＋Pi
或 A＋B＋ATP＝AB＋AMP＋PPi
六大类编号依次为
1. 2. 3. 4. 5. 6
亚类编号依次为
1. 2. 3. 4. 5. 6…….
电泳速度，1~5速率逐渐变快
Km值不同
*生理及临床意义
用于解释发育过 酶
程中阶段特有的代谢 活
特征；
性
心肌梗死酶谱
同工酶谱的改变 有助于对疾病的诊断
正常酶谱
；
肝病酶谱
同工酶可以作为
遗传标志，用于遗传 分近期析发研现，究雄。性动物精子中
12 3 4 5
还有另一种同工酶LDH-X， 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化
辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的 方法除去(NAD+)。
辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超 滤的方法除去(FAD、FMN)。
二、酶的活性中 心
必需基团(essential group)
酶分子中氨基酸残基 侧链的化学基团中，一些 与酶活性密切相关的化学 基团。
• 目前将生物催化剂分为两类
酶 、 核酶（ribozyme）
第一节 酶的分类和命名
酶的分类与命名原则（自学为 主）
P酶和R酶数量高达数千种 要准确地识别各种酶，避免发生混乱或 误解，就必须建立一套酶的 分类(classification)和
命名(nomenclature) 的原则
国际系统分类命名法原则--
10生物技术蛋白质与酶工程复习题与答案
一. 名词解释1．生物酶工程又称高级酶工程它是酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
2．蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质。
3.多核糖体把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态4.固定化酶水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
在催化反应中以固相状态作用于底物5.酶反应器以酶或固定化酶为催化剂进行酶促反应的装置。
6．酶工程又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术7.生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。
8. motif (模体)指的是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的一个结构层次，又称超二级结构9. domain功能域生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域,特别指蛋白质中这样的区域10.PDB蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）是一个生物大分子，11. DNA shuffling体外同源重组技术。
通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。
12.生物催化剂是指生物反指应过程中起催化作用的游离或固定化细胞各游离或固定化酶的总称13.必需基团有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团(essential group)14.活性中心。
酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。
15.有性PCR dna改组16.DNA改组通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。
17.免疫传感器偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器。
18.易错PCR是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。
蛋白质与酶工程复习资料
酶工程复习提纲第一章绪论1.酶及酶工程的概念。
酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。
酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。
(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。
1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。
1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。
给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。
1902年，Henri提出中间产物学说。
1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。
1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。
人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。
Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。
现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。
3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。
医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。
（2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。
（3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。
食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。
酶工程复习提纲
酶工程复习提纲（1~5章）1.酶的化学本质是什么？蛋白质2.酶催化作用的特点3.蛋白质类酶的国际系统分类法（根据酶所催化的反应类型和机理4.蛋白质类酶的系统命名systematic name5.酶活力与酶反应速度，比活力的定义6.酶活力测定的常用方法（记大标题）7.酶活力单位的定义8.酶的生产方法（记大标题）9.什么叫生物学酶工程？10.酶为什么具有高度的专一性和较高的催化效率？11.蛋白质在体内的形成可以大致分为两个阶段是什么？12.Anfinsen提出的蛋白质折叠的热力学假说13.帮助正确折叠的蛋白质和酶有哪些？（记大标题）14.酶生物合成的模式（记大标题）15.主要的产酶微生物种类及各举3个例子16.酶制剂的安全检查包括哪些项目？17.细菌和放线菌、霉菌和酵母生长最适pH （范围）18.莫诺德生长动力学方程和产酶动力学方程（了解）19.植物细胞发酵产酶实例（举3个）20.举例说明植物细胞培养产酶的工艺过程21.常见的动物细胞培养的方式22.酶分离纯化三条基本原则23.酶分离纯化的3个阶段是什么？24.什么叫离子交换层析？包括哪2种离子交换剂？25.什么叫亲和层析？有哪些具体的方法？（如疏水层析、金属离子亲和层析等）疏水层析的原理？26.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理酶工程复习提纲（6~10章）1.溶液酶的不足之处。
2.固定化酶的定义3.酶的固定化方法（大标题及各举2个例子）4.酶固定化方法的选择依据是什么？5.固定化酶酶学特性的变化6.举例说明固定化酶的应用情况。
7.非水介质包括哪些？8.有机介质反应体系有哪些？9.水对有机介质中酶催化反应的影响10.酶在有机介质中的催化特性（记大标题）11.生物柴油的本质是什么？12.酶反应器按结构的不同分为哪些类型？英文缩写。
13.表9-1，掌握各种反应器适用的操作方式和酶14.酶在医药方面的应用有哪些方面？15.举例说明（3 个例子）可以通过酶活力变化进行疾病诊断。
蛋白质和酶工程复习材料
2012-2013上《蛋白质工程与酶工程》复习题一、蛋白质工程部分1.何为肽键？一个氨基酸的α氨基与另一个氨基酸的α羧基缩合脱去一分子水，可以形成一个共价酰胺键或称肽键。
2.超二级结构的定义。
（刘佳）超二级结构(supersecondary structure) ：是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体，通常有βαβ，βββ，αα，ββ。
3.二硫键的形成。
（刘佳）二硫键：由肽链中相应部位上两个半胱氨酸残基脱氢连接而成的4.天然蛋白质中主要的二级结构有哪些类型。
天然蛋白质中主要的二级结构包括α—螺旋、β—折叠、回折、环肽链、无规则卷曲等。
5.维持蛋白质三级结构的主要作用力：疏水作用力6.蛋白质变性。
蛋白质变性：天然蛋白质因受到物理和化学的因素影响，使蛋白质严格的空间结构受到破坏，（但不包括肽键的裂解），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质变性作用。
7.蛋白质按照形状、结构及溶解度分为哪几类？纤维状蛋白质（如胶原蛋白、角蛋白）、球状蛋白（如酶类）、膜蛋白（膜内、膜锚定蛋白）。
8.在设计转角时常选择的残基是哪些？Pro-Asn残基对。
P53（鸿秋）9.设计α螺旋时，其电荷应如何分布。
P63（鸿秋）带正电的氨基酸残基靠近C端，带负点的残基靠近N端。
10.设计α螺旋时，采用哪些氨基酸能使螺旋终结。
P63（鸿秋）Pro、Gly中断α螺旋11.何为定点突变。
定点突变是依据酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点来引入变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
12.蛋白质化学修饰的定义。
（刘佳）蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构发生改变的过程。
13.目前常用的体外翻译系统有哪些？（侯宇）1）兔网织红细胞系统2）麦胚提取物系统3）原核体外翻译系统(E．Coli S30 )（补充：体外翻译系统又称无细胞蛋白质合成系统，是一种相对胞内表达系统而言的开放表达体系。
蛋白质与酶工程第一章资料
目前国内外普遍采用酶法生产葡萄糖。采用 粗淀粉为原料，投料浓度可达50%（干物质计）， 得率高达110%，因不需要中和等环节，杂质含 量低，不需精制直接喷雾干燥成葡萄糖粉。此 法简要步骤是：以淀粉作成30-40%粉浆，在 pH6~6.5时加入-淀粉酶，90C左右液化到碘反 应消失，冷却到55~60C，在pH4.5~5.0时加入酶 化酶，保温糖化48h左右，几乎全部淀粉转化为 葡萄糖，再经脱色浓缩，结晶或喷雾干燥即为 产品，DE值达98%以上。 目前世界上淀粉糖达1000多万吨。
酶技术在食品工业中的应用
一、酶在淀粉加工中的应用 应用于淀粉加工中的酶种类很多，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、 糖化酶、葡萄糖异构酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等 等。 （一） 葡萄糖的生产 酸水解工艺缺点很多：①需用耐酸、耐压设备；②需用精制 淀粉为原料；③水解后需中和、色泽深，精制费用大；④淀 粉投料浓度低，仅20%；⑤葡萄糖收率低，不超过90%；⑥水 解时当DE值达到80%，因逆聚合反应生成 -键带苦味的龙 胆二糖等低聚糖，要精制除苦；⑦久贮后还因生成氧化甲基 糠醛而转变为褐色。
酶源：微生物 动植物 酶的分离提纯 化学修饰，固定化
化学与高分子 技术
人工酶的化学合成
工业：食品、 纺织、制药、 畜牧业等
研究与医学
酶与其他生物工程的关系
酶工程
基因工程 近代生 物工程 细胞工程 发酵工程 蛋白质工程
目前世界上已经发现的酶
目前已发现和鉴定的酶 大约有2500多种，在工 业上有应用前景的5060种，大规模生产和应 用的仅16种，小批量生 产的也仅200来种。
蛋白质结构
与功能
新酶分子
基因蓝图
新酶 突变酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
蛋白质与酶工程
蛋白质与酶工程重点1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。
3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。
5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。
6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。
8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。
10.酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。
11.酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。
12.微生物作为酶源的优越性：1）容易获得酶需要的酶类；2）容易获得高产菌株；3）生产周期短；4）生产成本低；5）生产易管理；6）提高微生物产酶的途径比较多。
蛋白质与酶工程复习资料
第一章一、蛋白质工程的产生：1，最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982-1985年间对酪氨酰-t-RNA合成酶的分子改造工作。
2，佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。
3，1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。
二，蛋白质工程的内容1、定义：广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。
2、内容：确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。
根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质三，蛋白质工程的程序蛋白质分子设计基因改造方案基因成或突变分离纯化蛋白质结构蛋白质分子基因克隆与表达目的基因和功能测定改造的蛋白质分子四，酶工程的应用范围（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。
其中固定化酶技术是酶工程的核心。
实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。
五，医用药物酶应用的问题：1）异体蛋白引起免疫反应；2）酶不纯，引起各种副作3）酶在体内降解，时间短；4）药物无法定向分布。
解决办法：1) 制成微胶囊；2) 制成衍生物；3) 制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白)；4) 酶上引入一定基团，起导向作用。
五，分子酶学与酶工程1、酶——由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或其它类型的生物大分子），是生物体进行代谢、维持生命活动的必需物质，没有酶就没有生命，因此研究酶的结构与功能、性质与作用机理，对于阐明生命现象的本质具有重要意义。
蛋白质与酶工程复习题.docx
一.选择题：1.影响蛋白质化学修饰反应的主要因素有：（）一是蛋白质功能基的反应活性；二是修饰剂的反应活性。
2.蛋白质化学修饰有以下作用（以酶为例），请指出错误的一条：（）（1）改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）；（2）提高酶的稳定性；（3）扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）.3.蛋白质侧链上的蔬基在进行烷基化修饰吋，常用的烷基化试剂是：（）碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马來酰亚胺、5, 5-二硫-2-硝基苯甲酸4.下面哪一项叙述是错误的：（）5.人类基因组计划的启动和草图完成时间在：（）1990年正式启动，2000年6月26日人类基因组工作草图完成。
6.人类基因组计划的启动到人类基因组序列图测序完成吋间在：（）1990年正式启动到2003年4月14 H7.通过比较两个或多个蛋白质序列的相似区域和保守性位点，确定相互间具有共同功能的序列模式和分子进化关系，进一步分析其结构和功能。
此方法为：（）序列两两比对& 通过对日标蛋白质进行定位突变或化学修饰改变其结构和功能，为蛋白质分子设计中的：（）称为“小改“，最广泛使用的方法，主要是通过定点突变或盒式替换技术來有冃的地改变几个氨基酸残基9.通过对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接和组装，为蛋白质分子设计中的：（）“中改“，”分子剪裁“10.完全从头设计出一种具有特异结构与功能的全新蛋白质，为蛋白质分子设计屮的：（）“全新蛋白质设计“或”蛋白质从头设计“11下而哪一条不是真核基因在原核屮正确表达的必备条件：（）第一，克隆到原核表达系统中的序列必须是去掉内含子的cDNA序列；第二，要用原核的启动子；第三，真核基因可能在表达过程中需要有分子伴侣帮助折叠成正确的构象才会有活性；第四，注意控制表达条件，尽量不要形成包涵体。
12外源基因在大肠杆菌（）高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。
蛋白质与酶工程复习资料
蛋白质与酶工程概述1 相关概念、2 蛋白质工程概述、3 酶工程概述一、相关概念1、工程：根据科学原理和有关技术，组合出高效、合理的技术系统，它除了要考虑技术的先进性和可行性，还要考虑成本和质量，做到经济、实用、美观，要考虑对环境的影响，以避免污染它的成功有赖于多种科学技术的综合集成和科学的管理2、生物工程( Bioengineering, Biologic engineering)：以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：遗传工程（基因工程）、蛋白质工程、细胞工程、微生物工程(发酵工程)、酶工程(生化工程)、生物反应器工程3、细胞工程（cell engineering ）：应用细胞生物学、分子生物学和工程学的原理和技术，在细胞或亚细胞水平上，通过细胞融合、核移植、细胞器移植或染色体操作，有目的地制造特定的细胞、细胞产品或新生物体的一门生物技术（如：改良生物品种，创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质）。
在细胞水平上动手，也称细胞操作技术。
狭义的细胞工程：指细胞融合和细胞培养技术。
广义的细胞工程：所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术（动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、单克隆抗体技术、核移植和胚胎移植技术等）二、比较不同的工程三、蛋白质工程1、定义：以蛋白质分子的结构及其与功能的关系作为基础，通过理化和DNA重组等方法对基因和蛋白质进行有目的地设计、改造和修饰，最终获得满足人类生产和生活需求的新型蛋白质（天然蛋白质的改造，或是纯新蛋白质）2、研究内容：（1）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质（2）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。
此利于从aa序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，以设计合成具有特定功能的全新蛋白质。
具体包括：蛋白质分离纯化、结构功能分析、设计和预测；通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质3、蛋白质工程原理：中心法则、中心法则的逆推4、蛋白质工程与基因工程的关系1）都以中心法则为根本的理论基础2）蛋白质工程是基因工程的发展，“第二代基因工程”3）基因工程是实现蛋白质工程的重要手段4）蛋白质工程通过基因工程加速着蛋白质的进化过程5、蛋白质工程的目的和主要内容1）目的：以蛋白质的结构及其与生物功能的关系为基础，通过修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更符合人类需要的新型蛋白质2）蛋白质工程的核心内容①蛋白质结构分析：收集大量的蛋白质分子结构信息，建立结构与功能的关系的数据库，为阐明蛋白质结构与功能的关系奠定基础。
蛋白质与酶学 复习资料
二、蛋白质分离纯化的一般原则（一）分离对象的检测应该能“看到”和“识别”要分离得到的蛋白质，或是从它的分子质量加以“识别”，或是通过特征的吸收光谱“看到”它们，最重要的是从它的生物活性上加以“识别”。
(二）分离方法的分类和选择、组合和优化如果原料充足，可以用盐析之类以溶解度为基础的分离方法，超滤也可以作为首选的方法。
在选择所用的方法时，应该尽可能地选用不同原理的分离方法，并加以组合；或选用类似的方法，但是要改变分离条件。
通常以电荷为基础的分离方法与以分子质量为基础的方法组合后，就可以得到满意的结果。
在各类方法组合和优化时，经常首选的方法是亲和层析。
因为该方法可以将不具所需样品活性的其他蛋白质一次性从亲和层析步骤中分离除去。
第二章第一节蛋白质的功能一、作为信息分子和信号的转导分子（一）作为信号的蛋白质作为信号分子的蛋白质包括激素、生长因子、细胞因子等。
它们的共同特征是：作为特异的配体，作用于细胞表面的受体，进而通过细胞的各种信号转导途径，最终作用与基因，引起某些蛋白质的表达。
其结果或是促进某些细胞增殖，或是对机体的整体平衡进行调节，或是对外来刺激作出应答。
属于激素类型的蛋白质有胰岛素、生长激素等。
属于生长因子类的蛋白质有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、促红细胞生长素等。
细胞因子中的绝大多数参与细胞免疫调节，实际上，也与机体的防卫有关。
它们中最常见的有白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等。
（二）起信号转导作用的蛋白质目前普遍认为信号转导过程存在与细胞中，信号的最终转导者是细胞膜上的受体。
细胞外各种各样的信号分子，首先是与其在细胞表面的特异的受体结合，将信息从细胞外转导到细胞内；然后引发细胞内的信号转导。
在细胞质内的信号转导途径不是单一的，而是呈网络状。
各种类型的激酶是细胞质中信号转导的主导者。
（三）各种类型的转录因子信号转导犹如接力过程，其间最后一棒是转录因子。
一旦信号转导过程激活了转录因子，后者将作用于基因，诱导基因的表达。
蛋白质与酶工程
♦ 没有酶的专一性，细胞中有秩序的物质代谢将不复存
在。酶的专一性对酶工程的发展具有重要意义。
♦ 酶可催化正、逆双向反应。
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(3)酶活性可调节
♦ 生命是严格有序的 一方面这种有序过程依赖于酶的催化作用； 另一方面，酶又必然受到这个有序过程的严格调控。
♦ 酶的量、酶的半衰期、酶的活性都是可以控制的 酶水平的调控是代谢调控的基本方式。
6．分子伴侣
♦ 蛋白质中二硫键的形成和少数蛋白质的折叠有赖于 叫做分子伴侣（chaperon）的酶或蛋白质的协助。
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第三节 蛋白质工程的类型
一、蛋白质的设计及改造
1．全新设计——按照人的意志设计合成自然界从未有的 蛋白质 蛋白质工程中最有意义、最为困难的操作类型。
♦ 往往应用于蛋白质类药物研究 如，艾滋病。人们根据艾滋病毒壳蛋白的结构，设计出 能够将其水解的酶。
3．天花粉蛋白改造 ♦ 优点 抑制肿瘤细胞的生长和艾滋病病毒的复制 ♦ 缺点 毒副作用强，造成过敏 ♦ 结构特点 引起毒副作用的结构部分和有用的活
性部分可分开 ♦ 改造设想 降低毒性，单独合成天花粉蛋白的治
病部分，其毒副作用即可排除。
4．抗体蛋白人源化 ♦ 当前用鼠等动物生产人的抗体容易引起不利的
链接
1．Anfinsen一级结构决定空间结构理论 ♦ 只要合成了某种蛋白质的一级结构，空间结构自
动形成 ♦ 人工合成胰岛素的实践初步证实了这一论断
但许多蛋白质从一级结构到空间结构的折叠 过程并非像胰岛素和牛胰核糖核酸酶那样简单。
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2．同源蛋白、蛋白质家族
♦ 蛋白质有结构上的分子进化同源性 ♦ 在预测一种新的蛋白质空间结构时，首先可以在
♦ 大部分酶的特性不适合于工业应用 ♦ 水解酶和异构酶是工业应用的首选酶 ♦ 世界上销售量最大的5种酶 细菌蛋白酶、葡萄糖淀粉
蛋白质与酶工程-期末考试资料
第一章绪论1、蛋白质工程:广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。
2、蛋白质工程的研究内容：（1）确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。
（2）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。
3、酶工程：酶工程（enzyme engineering ）是指从细胞和分子水平上对酶进行改造和加工，使酶最大限度地发挥其效率的过程。
虽然目前已发现少数酶具有核酸本质，但目前一般所指的酶工程主要对象是化学本质为蛋白质的酶类。
4、酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。
5、酶的分类：①主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶）②主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）6、“基因工程＋发酵工艺＋先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。
7、酶的催化作用特点：①催化效率高、②专一性强、③反应条件温和、④反应容易调节控制、⑤需要辅因子参与作用8、生物技术的四大支柱：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程。
基因工程：“剪刀+糨糊”跨越物种界限的工程。
细胞工程：微观水平的嫁接技术。
酶工程：让工业生产高效、安静而环保的工程。
发酵工程：将微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。
第二章蛋白质结构基础9、在有机体内通过生物合成连接成多肽链，其顺序由编码基因中的核苷酸三联体遗传密码决定。
10、20种常见氨基酸中，19种都具有如下共同的化学结构：RH2N-C H-CO2H另有一种脯氨酸具有类似而不相同的化学结构。
11、20种氨基酸在蛋白质中是通过肽键(peptide bond)连接在一起的。
一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接称为肽键：12、结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域(domain)。
第三章蛋白质分子的设定13、大改、中改、小改、第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；小改是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最为广泛使用的方法。
蛋白质与酶工程知识点完---仅供
1、易错PCR:通过调整反应条件来使PCR扩增过程中复制错配率增加，在目的基因中随机引入突变，继而获得蛋白质分子的随机突变体* 提高镁离子浓度或加入锰离子* 降低体系中一种的dNTP浓度（至少5-10%）* 运用低保真度DNA聚合酶* 增加DNA聚合酶的浓度属于无性进化：单一基因进行遗传突变，费力、耗时，多用于小片段（800bp以下）2、酶的概念：酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白质和核酸3、辅酶:与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。
辅基:与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去(FAD、FMN)酶的活性中心：或称活性部位，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。
4、抗体酶或催化抗体：是具有催化功能的抗体。
本质：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反应特点：①酶促反应具有极高的效率②酶促反应具有高度的特异性：绝对特异性、相对特异性、立体结构特异性③酶促反应的可调节性：对酶量的调节，对酶活性的调节6、诱导契合假说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。
这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。
7、底物浓度对反应速度的影响：①当底物浓度较低时：反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。
②随着底物浓度的增加：反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。
③当底物浓度高达一定程度：反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应8、Km与Vmax的意义9、不可逆性抑制作用：抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。
可逆性抑制作用：抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。
类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
三种抑制剂的特点10、酶的调节：❖酶活性的调节（快速调节）①酶原与酶原的激活②变构（別构）酶③酶的共价修饰调节❖酶含量的调节（缓慢调节）①酶蛋白合成的诱导和阻遏②酶降解的调控11、酶原激活的意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体代正常进行。
蛋白质与酶工程复习题
蛋⽩质与酶⼯程复习题1. 名词解释1．⽣物酶⼯程：在化学酶⼯程基础上发展起来的、酶学与现代分⼦⽣物学技术相结合的产物。
其主要研究内容为⽤基因⼯程技术⼤量⽣产酶、⽤蛋⽩质⼯程技术定点改变酶的结构基因、设计新的酶结构基因⽣产新酶。
2．蛋⽩质⼯程：是以蛋⽩质空间结构及其与⽣物学功能的关系为基础，通过分⼦设计和由设计结果所指导的特定的基因修饰，⽽实现的对天然蛋⽩质的定向改造。
3.多核糖体：在蛋⽩质合成过程中,同⼀条mRNA分⼦能够同多个核糖体结合，同时合成若⼲条蛋⽩质多肽链，结合在同⼀条mRNA上的核糖体就称为多聚核糖体4.固定化酶：固定在载体上并在⼀定的空间范围内进⾏催化反应的酶。
5.酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进⾏酶促反应的装置称为酶反应器。
以尽可能低的成本，按⼀定的速度由规定的反应物制备特定的产物。
6．酶⼯程：将酶学理论与化⼯技术相结合，研究酶的⽣产和应⽤的⼀门新的技术性学科。
包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等⽅⾯内容。
7.⽣物传感器：是⼀类由⽣物学、医学、电化学、光学、热学及电⼦技术等多学科相互渗透⽽成长起来的分析检测装置。
具有选择性⾼、分析速度快、操作简单、价格低廉等特点。
8. motifs（超⼆级结构）:相邻的⼆级结构单元组合在⼀起，彼此相邻相互作⽤，排列形成规则的、在空间上能够辨认的⼆级结构组合体，并充当三级结构的构件，成为超⼆级结构，介于⼆级结构与结构域之间的结构层次。
10. domains(结构域):多肽链在超⼆级结构的基础上进⼀步折叠成紧密的近乎球状的结构，这种结构称为结构域12.PDB：蛋⽩质数据库：汇集已知蛋⽩质各种参数的集合。
13. DNA shuffling：（⼜叫有性PCR）：将DNA拆散后重排，它是模仿⾃然进化的⼀种DNA体外随机突变⽅法。
15.⽣物催化剂：游离或活细胞的总称。
包括从⽣物体，主要是微⽣物细胞中提取出来的游离酶或经固定化技术加⼯后的酶。
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酶工程复习提纲第一章绪论1.酶及酶工程的概念。
酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。
酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。
(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。
1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。
1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。
给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。
1902年，Henri提出中间产物学说。
1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。
1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。
人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。
Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。
现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。
3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。
医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。
（2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。
（3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。
食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。
轻工业：用酶进行原料处理；用酶生产各种轻工、化工产品；用酶增强产品的使用效果。
第二章酶学基础1.酶的化学本质？酶与其他无机或者有机催化剂相比较，具有哪些催化特性？化学本质：生物催化剂。
催化特性：（1）高效率：比非催化高10^8—10^20倍；比非酶催化高10^7—10^13倍，酶催化反应的效率之所以高，是由于酶催化反应可以使反应所需要的活化能显著降低。
（2）高度专一性：相对专一性、绝对专一性。
相对专一性：键专一性：作用于具有相同化学键的一类底物；基团专一性：酶的作用底物含有某一相同的基因。
绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应。
（3）反应条件温和：一般在常温、常压、pH值近乎中性的条件下进行。
（4）酶催化是可调控的。
2.解释酶作用专一性机制的学说有哪些？其核心内容？（填空）锁钥假说：整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。
酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。
诱导契合假说：酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补性状。
当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心构象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。
3.解释酶作用高效性的机制有哪些？（1）邻近效应与定向作用（2）电子张力作用：应变效应，底物分子的敏感键产生张力或变形（3）多元催化作用。
酸碱催化：指通过向反应物提供质子或从反应物夺取质子而稳定过渡态、加速反应的一类催化机制。
共价催化：某些酶分子能作为亲核催化剂或亲电催化剂分别放出或汲取电子而与底物分子形成不稳定的共价中间络合物，反应活化能降低而加速反应，称为共价催化。
（4）酶活性中心的低介电区：表面效应，微环境效应。
4.什么是酶的活性中心？活性中心的构成？活性中心：是指酶分子中直接与底物结合并完成酶催化反应的结构区域，该部位化学基团集中，并构成一定空间构象。
活性中心的构成：结合中心：与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化中心：促进底物发生化学反应的部分，决定酶所催化反应的性质。
5.酶的一级结构、二级结构、三级结构和四级结构的概念，酶的四级结构与催化功能的关系？酶的一级结构：一级结构是指构成酶蛋白的氨基酸组成的一条长肽链或多肽链。
酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基础。
酶的二级结构：二级结构是指肽链骨架相邻区段借助氢键等沿轴向方向建立的规则折叠片与螺旋。
是所有的酶必须具备的空间结构，是维持酶活性部位所必需的构象。
酶的三级结构：三级结构指在二级结构基础上肽链进一步的折叠片与盘绕成二维空间结构，多肽链中原来相距较远的序列可以集中到一个区域内。
酶的四级结构：在三级结构基础上，由几个到十数个亚基(或单体)组成的寡聚酶或生物大分子称为酶的四级结构。
关系：1、具有四级结构的酶，其功能可分为两类：与催化作用有关,与代谢调节有关,酶蛋白的一级结构是酶具有催化功能的决定性部分，而高级结构为酶催化功能所必需部分6.什么是同工酶，举例说明？指能催化相同的化学反应，但酶蛋白本身的分子结构组成及理化性质不同的一组酶。
如：乳酸脱氢酶LDH，可装配成H4、H3M、H2M2、HM3、M4五种四聚体。
7.根据酶催化反应类型和机制不同，酶的分类？填空题（1）、氧化还原酶类：催化氧化还原反应（2)、转移酶类：催化分子基团从一个分子转移到另一个分子的反应（3）、水解酶类：催化加水分解的反应（4）、裂合酶类：双键上去除或加入一个基团的反应（5）、异构酶类：催化分子间重排的有关反应（6）、连接酶类：催化将两个分子连接在一起，并由ATP提供能量的反应8.酶活力及比活力？国际酶活力单位IU如何定义的？酶活力：在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的速度，可用时间单位内底物的减少量或产物的增加量来表示。
比活力：指在特定条件下，每毫克酶蛋白所具有的酶的活力单位数。
国际酶活力单位IU：在最适的反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，1IU=1μmol/min第三章酶促反应动力学1.酶促反应初速度的概念？在研究酶促反应动力学中，为准确的表示酶活力，一般都用初速度表示，即酶反应初始阶段，即底物转化量＜5%时的反应速度，也就是进程曲线的直线部分。
2.中间产物学说和过渡态理论？中间产物学说：酶的中间产物学说是由Brown（1902）和Henri（1903）提出的。
其学说主要认为酶的高效催化效率是由于酶首先与底物结合，生成不稳定的中间产物（又称中心复合物central complex）。
然后分解为反应产物而释放出酶。
在酶促反应中，酶首先和底物结合成不稳定的中间配合物（ES），然后再生成产物（P），并释放出酶。
反应式为S+E=ES→E+P，这里S代表底物，E代表酶，ES为中间产物，P为反应的产物过渡态理论：过渡态理论即活化络合物理论，（transition-state theory）。
过渡态：以量子力学对反应过程中的能量变化的研究为依据，认为从反应物到生成物之间形成了势能较高的活化络合物，活化络合物所处的状态叫过渡态。
过渡态理论是1935年由A.G.埃文斯和M.波拉尼提出的，研究有机反应中由反应物到产物的过程中过渡态的理论。
3.米氏方程的动力学描述形式，Km ,Vmax的动力学参数意义。
（3,4题合成一个大题）V=Vmax[S]/（Km+[S]）意义：（1）当v=Vmax/2时，Km=[S]。
因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度，它的单位是摩尔/升。
（2）Km可以反应酶与底物亲和力的大小。
Km越小，酶与底物亲和力越大。
（3）可用于判断反应级数：当[S]＜0.01Km时，反应为一级反应；当[S]＞100Km时，v=Vmax，反应为零级反应；当0.01Km＜[S]＜100Km时，为混合级反应。
（4）Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。
（5）Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，通过测定酶在不同底物存在时的Km值，Km值最小者，即为该酶的最适底物。
（6）可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，v=91%Vmax，认为此时为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。
4.如何测定Km ,Vmax? Lineweaver-Burk双倒数作图法的动力学表述形式。
5.酶激活剂的概念？激活剂的种类？酶的激活剂：凡能提高酶的活性，加速酶促反应进行的物质都称为激活剂或活化剂。
种类（按分子大小分类）：（1）无机离子：无机阳离子——金属离子（如钠离子、钾离子、镁离子等）；无机阴离子（如氯离子、溴离子等）；氢离子。
（2）中等大小的有机分子：某些还原剂，如半胱氨酸、巯基乙醇、抗坏血酸，作用机制是使酶中的二硫键还原成巯基，从而提高酶活性或与底物、酶或ES复合；EDTA（乙二胺四乙酸），作用机制是金属螯合剂，解除重金属离子对酶的抑制作用。
（3）具有蛋白质性质的大分子物质（如酶原激活）。
第四章酶反应器1.酶反应器的定义？用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。
2. 按结构区分，常见的酶反应器类型、定义及其特点？（类型有哪些以及填充式反应器的定义）大题定义特点搅拌罐式反应器：又称为批量反应器、间歇式搅拌罐。
由容器、搅拌器及保温装置组成，底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出，反应完成之后，酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应的一类反应器。
反应比较完全，反应条件比较容易调节控制填充床式反应器：将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）密度大，可以提高酶催化反应的速度。
在工业生产中普遍使用。
流化床式反应器：将底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，使固定化酶颗粒始终处于流化状态，使反应液的混合程度介于全混型和平推流型之间。
即可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时亦可用于需要供气体或排放气体（即固、液、气三相反应）的酶反应器称为流化床式反应器混合均匀，传质和传热效果好，温度和PH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应鼓泡式反应器：是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。
也是一种无搅拌装置的反应器。
结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高，适合于有气体参与的反应。
膜反应器：是一种将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器，可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。
清洗比较困难喷射式反应器通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的一类反应器称为喷射式反应器。