奶牛乳腺上皮细胞系的建立

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乳腺上皮细胞体外培养的研究进展

胞特性。以上种细胞系均不表达乳蛋白，能用不于泌乳相关研究，他的一些牛乳腺上皮细胞系可其以不同程度地表达乳蛋白。ＴＣ、ＭＥＵＭＡ — Ｅ — Ｂ — Ｖ、ＣＴ这三种牛乳腺细胞系都是通过转染Ｓ４ＬＡ基因Ｖ０Ｔ而永生化的。牛乳腺上皮细胞系ＢＥＵＭ－Ｖ可以表达低
汁的功能。分泌上皮细胞在妊娠期分化增殖，临在
乳腺中唯一具有分泌功能的细胞，研究乳腺泌乳是机制的着手点… 。但事实上，内腺体组织整体和局体部，括细胞外基质（包基质和基膜）间充质细胞等和
来还用于机体免疫机制的研究［，。１１０１１目前大多数研究主要通过单克隆培养或猿猴病毒大片段Ｔ抗原基因（Ｖ０Ｔ转染建立乳腺上Ｓ４ＬＡ）皮细胞系。单克隆培养操作复杂，养条件要求严培
分泌上皮、管上皮和肌上皮三者的混合培养，速导差
贴壁法和差时消化法很难将这三种上皮细胞分开，只有经过梯度离心等处理方法才可将其分开。Ｚｖｚｎ等（９６通过淋巴细胞分离液分离得到分ａｉｏｉ１９）泌上皮细胞，并转染含有猿猴病毒（Ｖ０ｔ５Ｓ４）ａ８序列ｓ
分化，皮细胞数量较多，上功能较活跃，取材的最是佳时期ｌ７＿。一般我们采用腺体组织样品进行细胞分

奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定

裂出少量的上皮细胞。培养８ｄ奶牛乳腺上皮细胞迅速增殖，形成岛屿状集落，呈单层 “ 鹅卵石” 和“ 铺路石” 形态生长。３）奶牛乳腺上皮细胞角蛋白１８鉴定为阳性。４）培养至ｌ０和２０代
的奶牛乳腺上皮细胞染色体数为６０条，具有正常的细胞二倍体核型。综上所述，采用组织块培养细胞能够获得具有稳定性、功能性的奶牛乳腺上皮细胞，但不是永生化细胞。
司，细胞角蛋白１８单克隆抗体、羊抗鼠荧光二抗
购自ＳａｎｔａＣｒＵＺ公司。
能［５－８３。本试验旨在对成功培养的奶牛乳腺上皮细胞系进行功能验证，为奶牛乳腺上皮细胞的泌
８期
詹
康等：奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定响
１．１试剂
白的研究并无对奶牛乳腺上皮细胞的泌乳营养的
研究。Ｈｕｙｎｈ等利用对温度敏感的突变体
ＳＶ４０Ｔ抗原基因转染原代的牛乳腺细胞建立了奶牛乳腺上皮细胞系，该细胞系保留了上皮细胞的典型特征，而且在激素的诱导下能够分泌乳蛋白。Ｚａｖｉｚｉｏｎ等建立了温度敏感的奶牛乳腺上
收稿日期：２０１５ — ０３ — ０２
基金项目：江苏省高校优势学科建设工作资助项目（ＰＡＰＤ）作者简介：詹康（１９８８一），男，江苏南京人，博士研究生，从事动物分子营养研究。Ｅ — ｍａｉｌ：ｚｈａｎｋａｎｇ０３０５＠１６３．ｃｏｍ通信作者：赵国琦，教授，博士生导师，Ｅ — ｍａｉｌ：ｇｑｚｈａｏ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ＣＤ

表达hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立

中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间，增加细胞传代次数，获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达ｈＴＥＲＴ和ＳＶ４０Ｔ可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。关键词：荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞；永生化；端粒酶；猿猴空泡病毒４０大Ｔ抗原
山东农业科学
２０１３，４５（２）：１— ４
ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
表达ｈＴＥＲＴ及ＳＶ４０Ｔ
永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立
ａｓｅｒｅｖｅｓｒｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｈＴＥＲＴ）ａｎｄｓｉｍｉａｎｖｉｕｓｒ４０ｌａｒｇｅＴｔｒａｎｓｆｅｅｔｅபைடு நூலகம்ｄａｎｔｉｇｅｎ（ＳＶ４０Ｔ）ｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆ
（１．ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＤａｉｒｙＣａｔｔｌｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｉｎａｎ２５０１３１，Ｃｈｉｎａ；２．ＰｏｕｌｔｒｙＩｍｔｉｔ￣ｅ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｆＡｏｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｅｉｎｃｅｓ，以Ｍｎ２５００２３，Ｃｈｉｎａ）

奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定

奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定一、奶牛乳腺上皮细胞系的培养1. 培养基的配制：奶牛乳腺上皮细胞系的培养液由DMEM/F12 (1:1)和10% FBS (fetal bovine serum)组成，并加入0.25μg/ml insulin, 0.5μg/ml transferrin, 10 ng/ml epidermal growth factor, 5ng/ml cholera toxin, 50ng/ml gentamicin和2mM glutamine。

2. 细胞悬液处理：将乳腺上皮细胞样本置于37℃恒温水浴中，将0.05% trypsin-EDTA滴入悬液中，反应3-5min，然后加入一定量的培养基（10-20ml），并将细胞悬液稀释200倍，再加入到培养皿中，以37℃、5%CO2、95%湿度培养。

3. 细胞培养：将细胞悬液加入培养皿中，在37℃、5% CO2、95% 湿度条件下培养，每天检查一次培养皿内的细胞生长情况，当细胞表面覆盖时，用0.25% trypsin-EDTA液将细胞脱离，再做稀释操作，重新放入培养皿中，继续培养。

二、奶牛乳腺上皮细胞系的鉴定1. 染色鉴定：将奶牛乳腺上皮细胞样本涂布到培养皿中，用Giemsa染色剂进行染色，观察细胞形态及核形态，以确定是否为奶牛乳腺上皮细胞。

2. 电镜观察：将奶牛乳腺上皮细胞样本涂布到培养皿中，采用透射电镜来观察细胞形态特征，如核形状、核大小、核周围细胞质等，结合Giemsa染色结果，可以准确判断细胞株的品系。

3. 免疫组化分析：用免疫组化的方法对奶牛乳腺上皮细胞样本进行分析，采用免疫细胞染色技术，将免疫组化分析结果与Giemsa染色结果和电镜观察结果结合起来，可以更加准确的识别出奶牛乳腺上皮细胞。

综上所述，奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定，主要包括培养基的配制、细胞悬液处理及细胞培养，以及染色鉴定、电镜观察和免疫组化分析三个步骤。

只有将这三种方法结合起来，才能准确的鉴定出奶牛乳腺上皮细胞系。

奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立

ｃｌＴｅｂｓｅｉｉ锄，Ｆ，ｖＶ＝１１ａｄ２％ｆａｂｖｎｅｍ（Ｂ），ｎｓｌ（ｇｍ，ｅ．ｈａｉｍｄｕｓ１ｃｍＩｌ／／（：）ｎ０ｅｌｏｉｓｒｔｅｕＦＳａｄｉｕｎ５ｔ／Ｉ）ｎｉ￣ｔｎｆｒｇ５ｔ／ｎ，ｙｒｏｔｏｅ（￣ｍ，ｐｇｓｒｅ（ｔ／Ｉ）ｐｎｃｌ１０Ｕｎａｄｒｓｒｎ（￣ｒｈｄｃｒｓｎ１ｔ／Ｉ）ｒｅｔｏａｅｉｇＩｏｉｇｏｅｎ１￣ｍ，ｅｉｌｎ（０Ｉ／１）ｎｇｉｉＩｓｅｔｙｉ（０ｍｗｒｄｄＴｅｃｌｃｌｒｎｔｌｔｅｉｉｅｗｓｏｅｄｗｔｃｌｇｎＴｅｔｐｍｃ１０ＩＩｅｅｄｅ．ｅｕｕｅｏｅｐｓｃｔｄｈｓａｃｖｒｉｏａｅ．ｒｏｎＵ／）ａｈｌｔｄｈａｉｐｒｓｅｈｌｈ
ｓｕｄｈｒｌｆｒｔｏｎｉｅｅｔａｉｎａｄｍｏｅｕａｅｈａｓｆｇｎｘｒｓｎｍａｍａｙｅｉｈｌｌｔｙｔｅｐｏｉｅａｉｎａｄｄｆｒｎｉｔｎｌｃｌｒｍｃｎｉｍｏｅｅｅｐｅｓｉｍｉｏｒｐｔｅｉａ
特异性分泌蛋白一酪蛋白的检测。证明培养获得的细胞为乳腺上皮细胞。且具有正常分泌乳蛋白功能。试验
初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系。
关键词：奶；腺上皮细胞；外培养体系牛乳体

双向电泳检测奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质方法的建立

双向电泳检测奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质方法的建立黄建国;高学军;李庆章;陆黎敏;骆超超;王佳丽;刘荣;乔彬;金鑫【摘要】为研究不同激素或营养素对乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响,本实验建立细胞核磷酸化蛋白质提取方法及双向电泳实验技术。

结果表明,细胞核磷酸化蛋白纯化结合双向电泳技术是乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学研究的有效方法,可为进一步研究乳腺上皮细胞机理提供技术基础。

%This paper describes procedures for the extraction,purification and 2-DE gel electrophoresis analysis of nuclear phosphorylated protein,with the aim of providing a basis for studying the influences of hormones and nutrients on nuclear phosphorylated proteins in dairy cow mammary gland epithelial cells （DCMGECs）.The established procedures proved effective approaches to proteomic analysis of nuclear phosphorylated proteins in DCMGECs and could provide a technical basis for further studies on the lactation mechanism of DCMGECs.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2011(034)006【总页数】4页(P250-253)【关键词】细胞核;磷酸化蛋白质;双向电泳;奶牛;乳腺上皮细胞【作者】黄建国;高学军;李庆章;陆黎敏;骆超超;王佳丽;刘荣;乔彬;金鑫【作者单位】东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】TQ937细胞核内蛋白质磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动[1]。

牛乳腺上皮细胞SNAT2对氨基酸调节乳合成的影响

牛乳腺上皮细胞SNAT2对氨基酸调节乳合成的影响孟春雨;黄鑫;刘丽杰;陈东莹;高学军【摘要】试验旨在研究氨基酸转运体钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白(the sodium-dependent neutral amino acid transporter 2,SNAT2)在牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)中对氨基酸调节乳合成的影响.利用组织块法成功培养原代BMEC,添加不同氨基酸(蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)刺激BMEC后,通过实时荧光定量PCR、Western blotting技术和甘油三酯试剂盒检测SNA T2、酪蛋白(β-casein)基因的表达量和BMEC培养液上清甘油三酯的分泌量;将N-flag-SNAT2真核表达载体及SNAT2 siRNA分别转入细胞中进行SNA T2基因的过表达和敲低试验;通过Western blotting和甘油三酯试剂盒分别检测SNAT2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)、β-casein蛋白表达量和BMEC培养液上清的甘油三酯含量.结果显示,3种氨基酸(Met、Lys、Leu)均能显著促进BMEC分泌乳蛋白和乳脂,并激活mTOR信号途径,其中Met、Lys还能够显著上调SNA T2基因表达;SNAT2能够正向调节BMEC乳蛋白和乳脂肪的合成,并激活mTOR信号通路,说明氨基酸激活mTOR信号通路是通过SNA T2基因介导完成的,进而调节了BMEC乳蛋白和乳脂肪合成.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)008【总页数】9页(P2119-2127)【关键词】氨基酸;SNAT2基因;mTOR;乳蛋白;乳脂肪【作者】孟春雨;黄鑫;刘丽杰;陈东莹;高学军【作者单位】东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 ,哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 ,哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 ,哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 ,哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室 ,哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S823氨基酸是机体重要功能物质合成的必需前体物，在维持机体正常的生长、发育和繁殖方面发挥着重要作用[1]。

奶牛乳腺上皮细胞的二维和三维培养及培养后酪蛋白基因的表达

是研究奶牛泌乳调控的有效的生物模型 � 起初研究者们利用二维培养的模式培养乳腺上皮细胞，通过二维培养细胞可以快速分裂，进而获得大量的均一的细胞，因此在定量分析 � 特征鉴，定和标本复制等方面有许多优点但却缺失了乳腺上皮细胞的许多组织学特征，即: 细胞的极化形态� 特殊的细胞间的相互作用及细胞和基质之间的相互作用 � 而乳腺上皮细胞极化结构的发育和
收稿日期 : 20 11 - 12 - 28
，这使的研究者们越来越关注培养模式对细胞代谢功能的影响 � 虽然在医学领域细胞的结果高密度重构的三维培养已广泛应用于癌症的研究［9 -12］，但在国内外利用三维培养研究乳腺上皮细胞中营养物质调控乳蛋白合成机理的却较少，在国外利用三维培养进行乳蛋白合成及分泌调控的研究主要是以鼠的乳腺上皮细胞为模型，且主要研究基质及激素在乳腺上皮细胞分化和蛋白质
G ib c o 公司) ; 根据试验需要，向其中添加胰岛素转 ( I TS ， Si g m a 铁蛋白美国公司) � 表皮生长因子 ( E G F， g m a 公司 ) � oc or t i美国 Si 氢化可的松 ( hydr s one ， He ，美国 Si g m a 公司 ) � 催乳素 ( pr ol a c t in，美 l one 国 Sigm a 公司) � 标准胎牛血清 ( FB S ，美国 H yc t r i ge l ， bc o 公司 ) � 公司 ) 和基质 ( m a 美国 G i 二维培养所用的培养基为生长培养基和终止培养基，三维培养所用的培养基为贴壁培养基和分化培养基，培养基组成见表 1�

双向电泳检测奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质方法的建立

ＷＡＮＧＪａｌ，ＬＵｏｇＱＡＯＢｉ，ＪＮＸｉｉ— ｉＩＲｎ，ＩｎＩｎ（ｙＬｂｒｔｒｔｉｃｅｃ，ｎｓｙｏｄｃｔｎＮｏｔｅｓＡｒｕｔｒｌｉｅｓｙＨａｂｎ１０３，ｈｎ）Ｋｅａｏａｏｙｏ’ ｒＳｉｎｅＭｉｉｒｆｕａｏ，ｒａｔｇｉｌａＵｎｖｒｉ，ｒｉ５００ＣｉａＤａｙｔＥｉｈｃｕｔ
（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨１０３）５００
摘要：为研究不同激素或营养素对乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响，本实验建立细胞核磷酸化蛋白质提取方
法及双向电泳实验技术。结果表明，细胞核磷酸化蛋白纯化结合双向电泳技术是乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学研究的有效方法，可为进一步研究乳腺上皮细胞机理提供技术基础。
ｅｅｔｅａｐｏｃｅｒｔｏｃａａｙｉｏｕｌａｈｓｈｒｌｔｄｐｏｅｎｎＤＣＭＧＥＣｓａｄｃｕｄｐｏｉｅａｍｃｍｃｆｃｖｐｒａｈｓｔｐｏｅｍｉｌｓｓｆｎｃｅｐｏｐｏｙａｅｒｔｉｓｉｉＯｎｒｏｌｒｖｄｈａｎｌ
ｐｈｏｐｒｌｔｄｏｔｉｗｉｅａｍｏｄｉｇａｂａｉｏｔｄｎｇｔｅｉｌｅｅｆｈｏｍｏｎｓａｎｕｔｉｎｔｕｃｅｒｓｈｏａｅｐｒｅｎ，ｔｔｉｏｆｐｒｖｉｎｓｓｆｒｓｙｉｎｆｕｎｃｓｏｒｙｈｈｕｈｅｄｎｒｅｓｏｎｎｌａ

水牛乳汁中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定

水牛乳汁中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定段安琴;庞春英;朱鹏;邓廷贤;陆杏蓉;马小娅;梁莎莎;梁贤威【摘要】This study was aimed to set up a simple,economic and pure method to culture and identify buffalo mammary epithelial cell invitro,which were collected from the fresh milk.The milk was collected in the late lactation period of the high yield milk buffalo,then it was mixed with the PBS in the ratio of 2 ∶ 1 and centrifugated.A few suspernatants and the pellets were resuspended with the PBS when the milk fat were decanted,then recntrifuged.The final pellets and 1 mL of suspernatants were seeded in petri dish without fat,respectively.The isolated cells were mammary epithelial cells which were identified by cellmorphology,immunofluorescence,growth curve,cell viability and RT-PCR.The buffalo mammary epithelial cells were successfully isolated from both the pellets and supernatants.The cells and impurities were less in the supernatants than that in the pellets.The cells were cobblestone-like without fibroblasts and most in cell division.In the post-confluent culture,mammary epithelial cells formed dome structures and layer-separated growth.The cells expressed cytokeratin 18 was identified by immunofluorescence which was the marker of mammary cells.The cell growth curve and cell survival rate were measured.The results showed that the buffalo mammary epithelial cells were activity and easy to attach.The mammary epithelial cells were expressed of milk protein and milk fat related genes detected by RT PCR.The buffalo mammary epithelial cell linewere successfully isolated and identified from fresh milk,which estabilished foundation for the study of the mechanism of lactation,the amelioration of the quality of milk and the improvement of milk yield of buffalo.%试验旨在从水牛(Bubalus bubalis)乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞并对其进行鉴定,建立经济、便捷的水牛乳腺上皮细胞分离方法.通过无菌收集高产奶水牛泌乳后期乳汁,将其与PBS按2∶1(V/V)混匀离心;去除上层乳脂,取带少量上清的沉淀,与PBS按上述比例混匀再次离心;将脂肪层去除干净,取沉淀上方1 mL上清及沉淀分别接种于细胞培养皿.通过细胞形态、免疫荧光、生长曲线测定、细胞接种活力、RT-PCR 等对分离的细胞进行鉴定.结果表明,试验成功从水牛乳汁的上清和沉淀中分离获得了水牛乳腺上皮细胞,上清部分细胞和杂质较少;而沉淀部分则细胞和杂质较多.细胞呈典型鹅卵石样,无成纤维细胞,细胞活力好,多处于分裂期.当细胞增殖高度融合时,出现乳头状结构和分层生长现象.经免疫荧光鉴定,分离获得的水牛乳腺上皮细胞表达上皮细胞标志蛋白——细胞角蛋白18.水牛乳腺上皮细胞的生长曲线呈S型,符合一般生物学规律.细胞接种存活率的测定结果显示,细胞活力好、贴壁能力强.经RT-PCR检测,水牛乳腺上皮细胞表达乳蛋白及乳脂合成相关基因.从乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞并对其进行鉴定,成功建立了水牛乳汁分离乳腺上皮细胞的方法,为研究水牛泌乳机制、改善乳品质、提高产奶量奠定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)011【总页数】7页(P3243-3249)【关键词】水牛;乳汁;乳腺上皮细胞;原代培养【作者】段安琴;庞春英;朱鹏;邓廷贤;陆杏蓉;马小娅;梁莎莎;梁贤威【作者单位】中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S814.1中国南方属于热带、亚热带气候，高温高湿，荷斯坦奶牛在这种环境下疾病较多，产奶量明显下降，限制了奶产业的发展[1]。

消化酶、血清和催乳素对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

分类号 S815.8 学校代码 10129 U D C 636 学号 2009201035消化酶、血清和催乳素对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响Influence of Digesti ve Enzymes、FBS and Prolactin on culturing the Bovine Mammary Epithelial Cell申请人：杨银芬学科门类：农学学科专业：动物营养与饲料科学研究方向：反刍动物营养指导教师：侯先志教授高爱武副教授论文提交日期：二〇一二年六月摘要本研究通过对奶牛乳腺上皮细胞培养过程中几个关键的影响因素进行初步摸索，为以后利用乳腺上皮细胞研究营养因子对乳成分合成的影响奠定基础。

试验以泌乳期的奶牛乳腺组织为材料，进行了以下研究：1 探讨了75%酒精浸泡奶牛乳腺组织块、不同消化酶及浓度组合消化分离细胞和胎牛血清（FBS）浓度对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响。

取大小相同组织块在75%酒精中分别浸泡0s、30s、60s、90s、120s后消化分离细胞进行培养，观察细胞培养中的污染情况。

试验结果表明：组织块在75%酒精中浸泡60s细胞培养不污染，细胞生长最好；等量的组织块分别在0.5%Ⅰ胶原酶、0.5%Ⅱ胶原酶、0.2%Ⅰ胶原酶、0.2%Ⅱ胶原酶、0.25%胰酶+0.5%Ⅰ胶原酶、0.25%胰酶+0.5%Ⅱ胶原酶、0.25%胰酶+0.2%Ⅰ胶原酶、0.25%胰酶+0.2%Ⅱ胶原酶消化2h，获取细胞后进行培养，观察消化过程中组织块的变化以及原代培养的细胞生长状况。

试验结果表明：0.25%胰酶+0.2%Ⅱ胶原酶消化的组织块生长的乳腺上皮细胞最多，状态最好，后期生长状态最佳。

配制含0%FBS、5%FBS、10%FBS、15%FBS、20%FBS的培养基，分别用这5种培养基培养细胞。

试验结果表明：含 5%与10% FBS的培养基培养的细胞数量无明显差异（p>0.05）,显著高于含0%、15%、20%FBS的培养基培养的细胞数量（p<0.05）；2 探讨了不同时间添加催乳素(PRL)对奶牛乳腺上皮细胞形态、活性及基因表达的影响。

《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》范文

《奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞原代培养与鉴定》篇一一、引言随着生物医学的快速发展，细胞培养技术已成为研究细胞生物学、病理学、药理学等领域的重要手段。

其中，原代培养技术是获取特定组织或器官细胞并进行研究的关键步骤。

奶牛作为重要的畜牧业资源，其乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养与鉴定对于研究奶牛乳腺疾病、乳腺生理功能以及药物筛选等方面具有重要意义。

本文旨在详细介绍奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的原代培养过程及其鉴定方法，以期为相关研究提供参考。

二、材料与方法1. 材料(1) 实验动物：健康成年奶牛。

(2) 试剂与耗材：胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、无菌器械等。

(3) 仪器设备：显微镜、离心机、培养箱、手术器械等。

2. 方法(1) 乳腺组织获取：从健康成年奶牛的乳腺中获取组织样本。

(2) 组织消化与细胞分离：将组织样本进行消化处理，分离出乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

(3) 细胞原代培养：将分离得到的细胞接种至培养皿中，加入培养基，置于培养箱中培养。

(4) 细胞鉴定：通过显微镜观察细胞形态，进行免疫组化染色等方法鉴定细胞类型。

三、实验过程1. 乳腺组织获取与处理首先，从健康成年奶牛的乳腺中获取组织样本。

然后，将组织样本进行清洗，去除血液和杂质。

接着，使用无菌器械将组织剪成小块，便于后续的消化和细胞分离。

2. 细胞分离与原代培养将处理好的组织样本放入含有胰蛋白酶的培养基中，进行消化处理。

消化完成后，通过离心、过滤等步骤分离出乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

将分离得到的细胞接种至培养皿中，加入含血清的DMEM培养基，置于培养箱中培养。

3. 细胞鉴定对培养的细胞进行显微镜观察，记录细胞的形态、生长情况等。

然后，通过免疫组化染色等方法鉴定细胞类型。

鉴定过程中需设置阳性对照组和阴性对照组，以确保结果的准确性。

四、结果与分析1. 细胞形态与生长情况通过显微镜观察，可见乳腺上皮细胞呈圆形或椭圆形，贴壁生长，形态规整；成纤维细胞呈梭形或星形，生长迅速，铺路石样排列。

绿原酸抗乳腺炎作用及机制研究

绿原酸抗乳腺炎作用及机制研究大肠杆菌等革兰氏阴性菌是乳腺炎常见的致病菌。

这些革兰氏阴性菌中，能够使宿主机体组织器官受到损伤的主要致病因子是脂多糖（LPS）。

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的特殊成分，其能够激活TLR4（Toll-like receptor4）信号转导通路，进而使宿主机体产生炎性反应，过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR-γ）在这个过程中能够起到重要的调控作用。

本课题以我国中草药中存在的天然成分绿原酸为研究对象，首先在小鼠乳腺炎模型上证实其对炎症的抑制效果，其次分别对绿原酸在小鼠乳腺上皮细胞和奶牛乳腺上皮细胞上抗炎机制进行研究，最后对其作用靶标进行初步确认，从而为兽医临床实践中抗炎治疗提供新思路，为相应抗炎药物的研发提供初步的实验数据和理论基础。

首先，通过LPS诱发小鼠来建立乳腺炎损伤模型。

我们选取18只Balb/C 小鼠，雌雄比例2:1，混养后自由交配受孕，雌鼠在泌乳5～7天后，将其随机分为2组，LPS刺激组和空白对照组，6只/组。

LPS刺激组雌鼠在其第四对乳头处分别灌注LPS50μL（0.2mg/mL），在灌注24h后将其脱颈处死；空白对照组的雌鼠不进行任何处理。

通过肉眼观察LPS刺激组雌鼠的乳腺组织的病理学变化；对获得的雌鼠乳腺组织分别制作组织病理学切片和MPO的免疫组织化学切片，观察乳腺的病理组织学变化和MPO在组织中的分布及活性；通过ELISA方法检测乳腺组织中TNF-α因子的表达水平。

实验结果表明，与空白对照组相比，肉眼观察到LPS刺激组雌鼠的乳腺组织出现明显的发红、肿胀、充血等病理学变化；组织病理学光学显微镜观察到乳腺的腺泡壁明显增厚、水肿，腺泡腔存在大量的嗜中性粒细胞；乳腺中MPO的分布与活性明显增加；乳腺中TNF-α因子的表达水平显著增多。

以上获得的数据与典型乳腺炎的指标完全一致，说明本实验成功建立了LPS诱发的小鼠乳腺炎损伤模型。

其次，利用所建立的LPS诱发小鼠乳腺炎损伤的模型，研究绿原酸对乳腺炎的保护效果及其作用机理。

奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响

中国畜牧兽医 2022,49(7):2506-2514C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响鲁文赓1,司琳清1,田春雨2,袁思琦1,谢何昕1,周继伟1,金吉东3,韩英浩4(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆163319;2.榆树市农业综合行政执法大队,榆树130400;3.科菲特饲料(长春)有限公司,长春130012;4.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆163319)摘要:ʌ目的ɔ探讨奶牛脂肪间充质干细胞(b o v i n e a d i p o s e -d e r i v e dm e s e n c h y m a l s t e mc e l l s ,b A D -M S C s )对氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力的影响㊂ʌ方法ɔ使用0㊁5㊁25㊁50㊁100㊁200μm o l /L H 2O 2处理奶牛子宫内膜上皮细胞2㊁4㊁6㊁8㊁12h 后,通过M T T 试验检测细胞存活率㊁流式细胞术检测细胞内活性氧(R O S )水平来筛选H 2O 2诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的最佳条件㊂在细胞划痕试验中设立对照组㊁H 2O 2组㊁b A D -M S C s 共培养组(1ʒ0.5)㊁b A D -M S C s 共培养组(1ʒ1)㊁奶牛乳腺上皮细胞(MA C T )共培养组(1ʒ0.5)和MA C T 共培养组(1ʒ1)共6组,分析奶牛子宫内膜上皮细胞迁移能力,并利用W e s t e r nb l o t t i n g 检测细胞外蛋白调节激酶(E r k )和磷酸化细胞外蛋白调节激酶(p E r k )蛋白的表达水平㊂ʌ结果ɔM T T 试验结果显示,4~12h 内50μm o l /L H 2O 2组细胞存活率为50%~80%,适用于构建氧化应激模型㊂流式细胞术结果显示,用50μm o l /L H 2O 2刺激奶牛子宫内膜上皮细胞2h 时,R O S 水平显著高于对照组与4㊁6㊁8㊁12h 组(P <0.05)㊂划痕试验结果显示,与对照组相比,H 2O 2组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力显著降低(P <0.05);与H 2O 2组相比,b A D -M S C s 共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力均显著增加(P <0.05),MA C T 共培养组细胞迁移能力均显著降低(P <0.05)㊂W e s t e r nb l o t t i n g 结果显示,与对照组相比,H 2O 2组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k 蛋白表达水平显著降低(P <0.05);与H 2O 2组相比,b A D -M S C s 共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k 蛋白表达水平均显著升高(P <0.05),M A C T 共培养组细胞中p E r k 蛋白表达水平均显著降低(P <0.05)㊂ʌ结论ɔ50μm o l /L H 2O 2处理2h 可成功构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型,b A D -M S C s 可促进氧化应激条件下奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移并参与调控E r k 蛋白的表达㊂关键词:牛脂肪间充质干细胞;氧化应激;奶牛子宫内膜上皮细胞;细胞迁移中图分类号:S 857.2+1文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.008 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-27基金项目:黑龙江省自然科学基金联合引导项目(L H 2020C 084);现代农业(奶牛)产业技术体系建设专项资金(C A R S -36)联系方式:鲁文赓,E -m a i l :l w g 1712@163.c o m ㊂通信作者韩英浩,E -m a i l :h y h b yn d @163.c o m E s t a b l i s h m e n t o fO x i d a t i v e S t r e s sM o d e l o fB o v i n eE n d o m e t r i a l E p i t h e l i a l C e l l s a n d t h eE f f e c t s o fB o v i n eA d i p o s e -d e r i v e dM e s e n c h y m a l S t e mC e l l s o nC e l lM i gr a t i o n L U W e n g e n g 1,S IL i n q i n g 1,T I A N C h u n y u 2,Y U A NS i qi 1,X I E H e x i n 1,Z H O UJ i w e i 1,J I NJ i d o n g 3,H A N Y i n gh a o 4(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,H e i l o n g j i a n g B a y iA gr i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,D a q i n g 163319,C h i n a ;2.Y u s h uC i t y A g r i c u l t u r a lC o m pr e h e n s i v eA d m i n i s t r a t i v e L a wE n f o r c e m e n tU n i t ,Y u s h u 130400,C h i n a ;3.C o f e e dF e e d m i l l (C h a n gc h u n )C o .,L td .,C h a n g c h u n 130012,C h i n a ;4.C o l le g e of L i f eS c i e n c e a n dT e c h n o l og y ,H e i l o n g j i a n g B a y iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,D a q i n g 163319,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h ea i mo f t h i s s t u d y w a s t oe x p l o r e t h ee f f e c to fb o v i n ea d i po s e -d e r i v e d m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s (b A D -M S C s )o n t h em i g r a t i o n o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e pi t h e l i a l c e l l s u n d e r7期鲁文赓等:奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响o x i d a t i v e s t r e s s.ʌM e t h o dɔB o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l sw e r e t r e a t e dw i t h0,5,25,50,100, 200μm o l/L H2O2f o r2,4,6,8a n d12h,a c t i v i t y w a sd e t e c t e db y MT Ta s s a y a n d i n t r a c e l l u l a r r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s(R O S)l e v e lw a sd e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r y,i no r d e r t os c r e e n t h eb e s t o p t i m u mc o n d i t i o no fo x i d a t i v es t r e s s m o d e lo fb o v i n ee n d o m e t r i a le p i t h e l i a lc e l l s.S i x g r o u p s i n c l u d i n g c o n t r o l g r o u p,H2O2g r o u p,b A D-M S C sc o-c u l t u r e g r o u p(1ʒ0.5),b A D-M S C sc o-c u l t u r e g r o u p(1ʒ1),MA C Tc o-c u l t u r e g r o u p(1ʒ0.5)a n dMA C Tc o-c u l t u r e g r o u p(1ʒ1)w e r e e s t a b l i s h e d i n t h e c e l l s c r a t c h t e s t,a n d t h em i g r a t i o na b i l i t y o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s w a sa n a l y z e d,t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f e x t r a c e l l u l a r r e g u l a t e d p r o t e i n k i n a s e s(E r k)a n d p h o s p h o r y l a t i o ne x t r a c e l l u l a r r e g u l a t e d p r o t e i nk i n a s e s(p E r k)p r o t e i nw e r e d e t e c t e db y W e s t e r n b l o t t i n g.ʌR e s u l tɔT h er e s u l t so f MT Ta s s a y s h o w e dt h a t t h ec e l l s u r v i v a l r a t eo f4-12h w a s 50%-80%w h e nH2O2c o n c e n t r a t i o nw a s50μm o l/L,w h i c hw a s s u i t a b l e f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o f o x i d a t i v es t r e s s m o d e l.F l o w c y t o m e t r y a s s a y r e s u l t ss h o w e dt h a t w h e n b o v i n ee n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l sw e r es t i m u l a t e d w i t h50μm o l/L H2O2f o r2h,t h eR O Sl e v e lw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h a t i n c o n t r o l g r o u p a n d4,6,8,12h g r o u p s(P<0.05).T h e r e s u l t so f s c r a t c ht e s ti n d i c a t e d t h a t c o m p a r e dw i t hc o n t r o l g r o u p,t h em i g r a t i o na b i l i t y o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i nH2O2g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d(P<0.05);W h i l e c o m p a r e dw i t h H2O2g r o u p,t h e m i g r a t i o na b i l i t y o f t h eb o v i n ee n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i nb A D-M S C sc o-c u l t u r e g r o u p sw a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05),a n d t h e c e l lm i g r a t i o na b i l i t y i n MA C Tc o-c u l t u r e g r o u p sw a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.05).T h er e s u l t so f W e s t e r nb l o t t i n g s h o w e dt h a t c o m p a r e dw i t h c o n t r o l g r o u p,t h e e x p r e s s i o no f p E r k p r o t e i n i nb o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i nH2O2g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.05);W h i l e c o m p a r e dw i t hH2O2g r o u p,t h e e x p r e s s i o no f p E r k p r o t e i n i nb o v i n ee n d o m e t r i a le p i t h e l i a l c e l l s i nb A D-M S C sc o-c u l t u r e g r o u p sw a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05),a n dt h ee x p r e s s i o n o f p E r k p r o t e i ni n MA C T c o-c u l t u r e g r o u p s w a s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d(P<0.05).ʌC o n c l u s i o nɔ50μm o l/L H2O2t r e a t m e n tf o r2h c o u l d s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t t h e o x i d a t i v e s t r e s sm o d e l o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s,a n db A D-M S C s c o u l d p r o m o t et h e m i g r a t i o no fb o v i n ee n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l su n d e ro x i d a t i v es t r e s s a n d p a r t i c i p a t e i n r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o no fE r k p r o t e i n.K e y w o r d s:b o v i n ea d i p o s e-d e r i v e d m e s e n c h y m a l s t e mc e l l s;o x i d a t i v es t r e s s;b o v i n ee n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s;c e l lm i g r a t i o n奶牛在围产期特别是产后其抗氧化能力降低,为满足分娩和泌乳等生理活动需求其代谢增加,高代谢水平将导致活性氧(R O S)产生增多,R O S的产生与抗氧化能力之间的不平衡促使氧化应激发生,继而影响子宫健康并促进子宫内膜炎的发生发展㊂研究表明,奶牛的急性子宫感染与脂质过氧化水平升高和抗氧化能力下降有关[1-4]㊂子宫内膜感染后,中性粒细胞到达子宫内吞噬病原体产生大量的R O S会通过激活促炎因子的转录来加剧炎症反应,并使蛋白质㊁脂质和D N A氧化,进而造成子宫内膜上皮细胞死亡,加重组织损伤[5-7]㊂因此,修复奶牛子宫内膜上皮的氧化损伤对子宫内膜炎的防治十分关键㊂尽管损伤后的组织修复和再生机制尚未明确,但相关研究表明其涉及细胞迁移和增殖㊁细胞外基质重塑等,而细胞外调节蛋白激酶(E r k)是信号从表面受体传导至细胞核的关键分子,参与调节细胞分化㊁增殖㊁迁移等多种生命活动[8]㊂间充质干细胞(M S C s)是由成体组织基质中获得的具有再生功能的多能干细胞,在损伤修复中发挥着重要的生物学功能[9]㊂张延玲[10]研究表明,月经血中子宫内膜来源M S C s可以修复损伤子宫并通过激活E r k来促进脐内皮细胞的迁移㊂随着现代医学对M S C s的深入研究,其在动物临床中的研究也愈加广泛,詹小舒等[11]研究发现,犬脐带M S C s来源的外泌体可以促进血管内皮细胞迁移;在奶牛中的研究发现,骨髓和脂肪M S C s的条件培养基均可在体外抑制金黄色葡萄球菌的活性,为兽医临床中奶牛乳腺炎的治疗提供理论基础[12-13]㊂L u等[14]研究发现,使用脂7052中国畜牧兽医49卷多糖(L P S)诱导体外奶牛子宫内膜炎模型后与奶牛脂肪间充质干细胞(b A D-M S C s)共培养可以显著抑制炎性反应与细胞凋亡,但b A D-M S C s对氧化应激导致奶牛子宫内膜上皮细胞损伤的作用还不清楚㊂由于H2O2会使细胞氧化并产生具有高度活性的自由基,被广泛用于细胞氧化应激模型的构建[15]㊂本试验使用H2O2构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型并探讨b A D-M S C s是否可以促进氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移,以期为临床上防治由氧化应激导致的奶牛子宫内膜上皮损伤提供新的思路㊂1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂 D M E M/F12购自G i b c o公司;胎牛血清(F B S)购自四季青公司;胰蛋白酶㊁青-链霉素㊁M T T试剂㊁活性氧检测试剂盒㊁E C L显影液均购自S o l a r b i o公司;H2O2购自S i m g a公司;E r k抗体㊁p E r k 抗体㊁β-a c t i n抗体均购自S a n t a公司;辣根过氧化物酶(H R P)标记的山羊抗鼠I g G二抗购自B i o B a s i c公司㊂1.1.2 主要仪器细胞培养箱(C B160)购自B i n d e r公司;酶标仪(E l x800)购自B i o T e k公司;流式细胞仪(C y t o F L E X)购自B e c k m a n公司;蛋白成像系统(A m e r s h a mI m a g e r600)购自C y t i v a公司㊂1.2方法1.2.1细胞的复苏与传代培养将黑龙江八一农垦大学动物产科学实验室分离培养并鉴定的原代b A D-M S C s与奶牛子宫内膜上皮细胞复苏并接种至培养皿中,待细胞汇合度达到80%~90%时,使用0.25%的胰蛋白酶消化细胞,待大部分细胞从培养皿底部脱落下来时,加入含10%F B S的培养基终止消化㊂随后将终止消化的细胞悬液以1000r/m i n 离心3m i n并重悬,以1ʒ2进行传代培养,使用第4代细胞进行后续试验㊂1.2.2 H2O2诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激最佳浓度筛选将奶牛子宫内膜上皮细胞以每孔1ˑ104个接种于96孔板中,待细胞汇合度为80%~ 90%时,弃去培养液,分别加入含有0(对照组)㊁5㊁25㊁50㊁100㊁200μm o l/L H2O2的培养基(D M E M/F12+ 1%F B S),分别刺激2㊁4㊁6㊁8㊁12h,每组3个重复㊂在每孔中加入5g/L M T T溶液10μL,于37ħ培养箱中避光孵育2h,每孔加入100μL细胞级二甲基亚砜(D M S O)溶液,于37ħ培养箱中避光孵育10m i n,测定各组D490n m值,计算细胞存活率㊂细胞存活率(%)=(试验组D490n m/对照组D490n m)ˑ100%㊂1.2.3 H2O2诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激最佳时间筛选将奶牛子宫内膜上皮细胞以每孔2.5ˑ105个接种于6孔板中,待细胞汇合度为80%~ 90%时,弃培养液,对照组加入不含H2O2的培养基, H2O2刺激组加入含50μm o l/L H2O2培养基,在2㊁4㊁6㊁8㊁12h收集细胞,使用P B S充分洗涤,离心后加入10μm o l/LD C F H-D A荧光探针重悬细胞,37ħ避光孵育15m i n,用P B S洗掉多余探针,用流式细胞仪在激发光488n m㊁发射光525n m下检测荧光强度㊂1.2.4b A D-M S C s对氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移的影响将奶牛子宫内膜上皮细胞以每孔2ˑ105个接种于6孔板中,待细胞汇合度为80%~90%时,弃培养液,对照组加入无H2O2的培养基,试验组加入50μm o l/L H2O2的培养基, 2h后使用200μL枪头均匀划线,用P B S洗去死细胞,拍照记录,此时记为划痕0h㊂将培养基全部更换为无H2O2的培养基,试验组使用孔径为0.4μm 的t r a n s w e l l,根据与奶牛子宫内膜上皮细胞共培养的细胞类型及小室接种细胞的密度构建不同的间接共培养体系,分为对照组㊁H2O2组㊁H2O2处理奶牛子宫内膜上皮细胞与b A D-M S C s按1ʒ0.5㊁1ʒ1共培养组(H2O2+b A D-M S C s(1ʒ0.5)组㊁H2O2+ b A D-M S C s(1ʒ1)组)㊁H2O2处理奶牛子宫内膜上皮细胞与奶牛乳腺上皮细胞(MA C T)按1ʒ0.5㊁1ʒ1共培养组(H2O2+M A C T(1ʒ0.5)组㊁H2O2+ M A C T(1ʒ1))组6组,按以上顺序记为1㊁2㊁3㊁4㊁5㊁6,24h后拍照记录,记为划痕24h㊂使用I m a g e J v1.51测量划痕之间的面积,分别与各组划痕0h 比较评估细胞迁移能力㊂1.2.5b A D-M S C s对氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞中E r k蛋白表达水平的影响收集1.2.4中各组奶牛子宫内膜上皮细胞,使用R I P A 裂解液提取蛋白,使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,根据蛋白浓度计算蛋白上样量,蛋白样品与蛋白上样缓冲液混合,每孔上样量为15μL,S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿转法转移至N C膜上,50g/L脱脂奶粉室温下封闭1h,与β-a c t i n(1ʒ1000)㊁E r k(1ʒ1000)㊁p E r k(1ʒ1000)抗体4ħ过夜孵育,室温下使用H R P标记的山羊抗鼠I g G二抗(1ʒ3000)孵育1h,曝光显影,利用I m a g e J v1.51统计灰度值,计算p E r k与E r k的比值表示p E r k蛋白的相对表达量㊂1.3数据统计分析用S P S S26.0软件进行单因素方差分析(O n e-W a y A N O V A),组间差异采用邓肯氏多重比较,结80527期鲁文赓等:奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响果用平均值ʃ标准差表示,P <0.05表示差异显著㊂用G r a ph P a dP r i s m8.0.2软件进行绘图㊂2 结果2.1 H 2O 2诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激最佳浓度的筛选由图1可知,5μm o l /L H 2O 2刺激奶牛子宫内膜上皮细胞2h 时,细胞存活率显著高于对照组(P <0.05),4㊁6㊁8㊁12h 组细胞存活率均低于对照组(P <0.05);25㊁50㊁100㊁200μm o l /L H 2O 2组细胞存活率均低于对照组(P <0.05),分别为70%~90%㊁50%~80%㊁10%~60%㊁10%~30%㊂因此,选取50μm o l /L H 2O 2构建氧化应激模型㊂2.2 H 2O 2诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激最佳时间的筛选由图2可知,用50μm o l /L H 2O 2刺激2h 时,细胞内R O S 水平显著高于对照组(P <0.05),4㊁6㊁8㊁12h 组R O S 水平均显著低于2h 组(P <0.05)㊂因此,后续试验选取50μm o l /LH 2O 2刺激2h 构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型㊂与0μm o l /L H 2O 2组相比,*,差异显著(P <0.05)C o m p a r e dw i t h0μm o l /L H 2O 2,*,S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05)图1 各组奶牛子宫内膜上皮细胞的存活率F i g .1 T h e s u r v i v a l r a t e o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i n e a c h g r o up①A ,流式细胞术检测R O S 的生成情况;B ,R O S 生成定量分析㊂②肩标不同字母表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P >0.05)㊂下同①A ,T h e p r o d u c t i o n o f R O Sw a s d e t e c t e d b y f l o wc y t o m e t r y;B ,Q u a n t i t a t i v e r e s u l t s o f t h eR O S p r o d u c t i o n .②V a l u e s w i t hd i f f e r e n t l e t t e rs u p e r s c r i p t s m e a ns i g n i f i c a n td i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l ew i t ht h es a m e l e t t e rs u p e r s c r i p t s m e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).T h e s a m e a sb e l o w 图2 H 2O 2诱导奶牛子宫内膜上皮细胞生成RO S 的情况F i g .2 T h eR O S p r o d u c t i o n i n d u c e db y H 2O 2i nb o v i n e e n d o m e t r i a l e pi t h e l i a l c e l l s 9052中国畜牧兽医49卷2.3b A D-M S C s对氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移的影响由图3㊁4可知,与对照组相比,50μm o l/L H2O2组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力显著降低(P<0.05);与H2O2组相比,b A D-M S C s共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力均显著增加(P<0.05),MA C T共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力均显著降低(P<0.05),且1ʒ0.5 b A D-M S C s和1ʒ1MA C T共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力分别显著低于1ʒ1b A D-M S C s和1ʒ0.5MA C T共培养组(P<0.05)㊂1,对照组;2,H2O2组;3,H2O2+b A D-M S C s(1ʒ0.5)组;4,H2O2+b A D-M S C s(1ʒ1)组;5,H2O2+MA C T(1ʒ0.5)组; 6,H2O2+MA C T(1ʒ1)组㊂图4㊁5同1,C o n t r o l g r o u p;2,H2O2g r o u p;3,H2O2+b A D-M S C s(1ʒ0.5)g r o u p;4,H2O2+b A D-M S C s(1ʒ1)g r o u p;5,H2O2+ MA C T(1ʒ0.5)g r o u p;6,H2O2+MA C T(1ʒ1)g r o u p.T h e s a m e a s f i g.4a n d f i g.5图3各组奶牛子宫内膜上皮细胞划痕试验结果(40ˑ)F i g.3T h e s c r a t c h t e s t r e s u l t s o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i n e a c h g r o u p(40ˑ)图4各组奶牛子宫内膜上皮细胞划痕间面积定量分析F i g.4Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e a r e ab e t w e e n s c r a t c h e s o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i n e a c h g r o u p2.4b A D-M S C s对氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞中E r k蛋白表达水平的影响由图5可知,与对照组相比,50μm o l/L H2O2组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与H2O2组相比,b A D-M S C s共培组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),MA C T共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),且1ʒ0.5b A D-M S C s和1ʒ1MA C T共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k蛋白表达水平分别显著低于1ʒ1b A D-M S C s和1ʒ0.5MA C T共培养组(P<0.05)㊂01527期鲁文赓等:奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的建立及奶牛脂肪间充质干细胞对其迁移的影响A ,p E r k ㊁E r k 蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 检测;B ,p E r k 和E r k 蛋白比值A ,p E r ka n dE r k p r o t e i n sw e r e d e t e c t e db y W e s t e r nb l o t t i n g ;B ,R a t i oo f p E r ka n dE r k p r o t e i n s 图5 各组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k 和E r k 蛋白表达水平F i g .5 T h e e x p r e s s i o no f p E r ka n dE r k p r o t e i n s o f b o v i n e e n d o m e t r i a l e p i t h e l i a l c e l l s i n e a c h g r o u p3 讨论氧化应激是指机体内R O S 生成过多㊁抗氧化能力下降造成的细胞及组织损伤,奶牛在围产期经历了营养㊁激素等多种变化导致机体内R O S 产生增多,使子宫内膜上皮细胞的结构和功能被破坏,从而易于被病原微生物感染㊂当细菌侵入子宫内膜后,中性粒细胞首先到达炎症部位去吞噬病原微生物,在这个过程中会产生大量R O S ,此时R O S 除了会造成细胞组织损伤外,还会通过激活细胞信号级联促进白细胞介素-1β(I L -1β)㊁肿瘤坏死因子-α(T N F -α)㊁I L -6等促炎细胞因子,加剧炎症反应,所以对R O S 造成细胞及组织损伤的修复对疾病的治疗也十分重要,但此过程在体外模拟较为困难㊂H 2O 2作为一种常见的R O S ,通常被用于探究自由基介导的氧化损伤机制及抗氧化剂对氧化损伤的修复机制,因此本研究选择H 2O 2作为奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型的应激源㊂细胞存活率和细胞内R O S 水平是评估造模是否成功的关键指标,最佳的造模条件既要极大程度减轻细胞损伤又要使R O S 水平显著升高,目前的试验结果显示50%~80%的细胞存活率均可以造模成功[16-18]㊂本试验结果发现,5μm o l /L H 2O 2刺激2h 时,细胞存活率高于100%,这是因为H 2O 2在低浓度时可以作为第二信使刺激细胞增殖[19-22],H 2O 2浓度为25㊁50㊁100㊁200μm o l /L 时细胞存活率分别为70%~90%㊁50%~80%㊁10%~60%㊁10%~30%,细胞存活率低于50%时细胞大量死亡且形成不可逆损伤,不适合作为造模条件[21],因此本试验最终选择用50μm o l /LH 2O 2作为最佳刺激浓度㊂为了进一步筛选最佳作用时间,本试验使用流式细胞术检测细胞内R O S 水平,结果表明,在2h 时细胞内R O S 水平较对照组显著升高,而4㊁6㊁8㊁12h 组较2h 组呈现出降低的结果,这是由于R O S 仅在活细胞中可以检测出,随着作用时间延长,奶牛子宫内膜上皮细胞的存活率逐渐降低,R O S 含量下降,仅能说明活细胞中的R O S 含量下降,这并不能代表由H 2O 2刺激产生总R O S 的含量[22]㊂本研究使用50μm o l /L H 2O 2刺激奶牛子宫内膜上皮细胞2h 来构建氧化应激模型并进行后续试验㊂这与张梦龙[23]㊁赵璧忱[24]得出的400μm o l /L H 2O 2刺激2h 有所区别,可能是由于H 2O 2化学性质活泼㊁不稳定,且不同的储存方式与其化学活性也息息相关,因此关于构建氧化应激模型的浓度和时间在不同实验室之间均存在较大的差异㊂另外,细胞的不同培养方法也可能会影响其对H 2O 2的耐受性,如不同的细胞培养液㊁冻存液及细胞在培养皿(瓶)的汇合度等㊂M S C s 作为一种多能干细胞,在现代临床医学中已被广泛应用于组织再生和自身免疫性疾病的治疗[25],M S C s 主要通过以下2种方式实现损伤组织的修复,第一种是通过其归巢能力迁移到受损部位发挥其功能[26],但是移植M S C s 在临床上具有一定风险与挑战,移植细胞存活率低㊁免疫排斥反应㊁到达损伤部位时间长,甚至动脉内注射M S C s 可导致心肌微梗死的发生[27];第二种是通过其旁分泌功能促进细胞的增殖迁移进而使受损组织或器官得以修复[28]㊂所以本研究使用细胞划痕试验并通过t r a n s w e l l 构建共培养体系来探究b A D -M S C s 是否可以通过旁分泌作用对氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞迁移起到积极作用㊂试验结果表明,与1152中国畜牧兽医49卷对照组相比,H2O2刺激降低了奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力,而与H2O2组相比,b A D-M S C s共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移能力显著增强,这可能是因为M S C s通过其旁分泌作用产生了丰富的生物活性分子,包括生长因子㊁趋化因子㊁细胞因子和小细胞外囊泡(如外泌体)等介质来调节免疫反应和损伤组织的修复㊂而MA C T共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞表现为迁移能力降低,这是因为在MA C T共培养组中划痕处有大量细胞坏死,脱离培养板底部,使划痕之间的面积增加,另外未发生氧化应激的MA C T也可能会竞争性地吸收培养基中的营养成分,加剧细胞坏死进程㊂研究发现,E r k蛋白参与调控多种生理病理过程中的细胞增殖与迁移[29-30],S h a b b i r等[31]研究证明,M S C s的外泌体可以通过E r k1/2信号通路促进正常和慢性创伤性成纤维细胞的迁移㊂本研究结果显示,b A D-M S C s共培养组奶牛子宫内膜上皮细胞中p E r k蛋白水平较H2O2组显著升高,但是与对照组相比,其迁移能力较高,p E r k蛋白水平却较低,这提示M S C s的旁分泌功能对细胞迁移的影响不仅是通过调控E r k信号通路来实现的㊂有研究表明, M S C s可以通过旁分泌作用激活多种与伤口愈合相关的信号通路,如蛋白激酶B(A k t)㊁E r k㊁细胞信号传导与转录激活因子3(S T A T3),并诱导多种营养因子的表达㊂特别是M S C s外泌体中含有S T A T3, S T A T3通过诱导大量基因表达以调控细胞增殖㊁迁移和血管生成,包括参与细胞周期控制的骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(c-m y c)㊁细胞周期蛋白(c y c l i n)㊁I L-6㊁肝细胞生长因子(H G F)㊁血管内皮生长因子(V E G F)[32-33],但其中所涉及的活性分子较多,机制复杂,且不同来源的M S C s分泌的活性分子在种类与含量上均存在一定的差异,所以关于其具体的活性分子及调控机制需要进一步深入探究㊂4结论本试验结果表明,用50μm o l/L H2O2刺激2h 可成功构建奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激模型㊂b A D-M S C s可以促进氧化应激状态下奶牛子宫内膜上皮细胞的迁移,且参与调控E r k蛋白的表达㊂结果为临床上治疗由子宫感染造成的奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤提供了新的思路㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B E R N A B U C C I U,R O N C H I B,L A C E T E R A N,e t a l.I nf l u e n c e o f b o d y c o n d i t i o n s c o r e o nr e l a t i o n s h i p sb e t w e e n m e t a b o l i cs t a t u sa n do x i d a t i v es t r e s si n p e r i p a r t u r i e n td a i r y c o w s[J].J o u r n a lo fD a i r y S c i e n c e,2005,88(6):2017-2026.[2] MA V A N G I R A V,S O R D I L L O L M.R o l e o fl i p i dm e d i a t o r si nt h er e g u l a t i o n o fo x i d a t i v es t r e s sa n di n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s i n d a i r y c a t t l e[J].R e s e a r c h i nV e t e r i n a r y S c i e n c 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牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定

牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定崔新洁;王婷;刘秉春;陶林;王潇【摘要】旨在建立简便、经济、纯净的牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,并对所培养细胞进行鉴定.以新鲜牛奶为材料,离心收集细胞进行原代培养并传代,通过测定生长曲线、乳腺上皮细胞骨架蛋白-角蛋白8和18、β-酪蛋白、核型等对所培养细胞进行鉴定,以确定其为乳腺上皮细胞.离心收集到的细胞原代培养3d后形成多个单克隆,细胞呈典型的铺路石状,同时伴随少量的吞噬细胞,继续培养至单克隆汇合时,细胞表层产生大小不等的乳滴,吞噬细胞大多转移到乳滴中,传代后,得到纯净的乳腺上皮细胞,吞噬细胞随传代而消失；细胞生长曲线呈“S”型,RT-PCR法扩增到了乳腺上皮细胞的骨架蛋白8、18以及β-酪蛋白,细胞免疫组化检测到了细胞角蛋白8,核型为29对端着丝粒常染色体,1对近端着丝粒性染色体.通过以上试验证明,乳汁分离法可以培养纯净的、具有正常分裂增生能力的牛乳腺上皮细胞,建立了乳腺上皮细胞的体外培养模型.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】7页(P107-113)【关键词】乳汁;牛乳腺上皮细胞;细胞骨架蛋白;泌乳【作者】崔新洁;王婷;刘秉春;陶林;王潇【作者单位】内蒙古大学生命科学学院,呼和浩特010010【正文语种】中文在奶牛乳腺炎的发病过程中，乳腺上皮细胞是与外界直接相通的细胞，乳腺上皮细胞上含有模式识别受体TLR，对机体的先天性免疫具有重要的作用。

除此之外，乳腺上皮细胞最重要的功能是泌乳。

因此建立简便、经济、纯净的乳腺上皮细胞的体外培养模型，对病原免疫学以及泌乳机制的研究都具有重要的意义。

1961年，Ebner等［1］第一次将乳腺上皮细胞在体外培养至30-40代，但是，随着传代次数的增加，大多数上皮细胞失去原有的特性，而表现成纤维细胞的特性。

之后多种方法被采用，以去除成纤维细胞的污染，如在培养液中添加D-缬氨酸以选择性地去除成纤维细胞，或密度梯度离心法，或胶原酶与胰酶共同消化法等［2-10］，但随着传代的进行，都不同程度地混有成纤维细胞的污染。

中药王不留行对奶牛乳腺细胞增殖及泌乳的影响

中药王不留行对奶牛乳腺细胞增殖及泌乳的影响李楠;高学军;关力【摘要】To determine the effects of Chinese traditional medicine Semen vaccariae on the proliferation and lactation fuction of bovine mammary gland epithelial cell, the water decoction was obtained from Semen vaccariae. The content of Semen vaccariae active material,dibutyl phthalate (DBP) was detected,and different concentration gradients of the drug extraction were observed for their influence on cell lactation. The most effective drug concentration was screened out for lactogenesis. The results showed that 2 mg/mL(crude drug concentration) proup was the most effective concentration for lactogenesis of bovine mammary gland epithelial cell. The results suggest that Semen vaccariae can act directly on bovine mammary gland epithelial cell for lactogenesis.%为确定中药王不留行对奶牛乳腺细胞泌乳功能的影响,以王不留行为原料,通过水浸提得到王不留行提取液,测出王不留行提取液中增乳活性物质邻苯二甲酸二丁酯含量,设置不同浓度中药提取液进行细胞试验,观察其对细胞泌乳的影响,筛选出增乳效力最显著的药物浓度.结果2 mg/mL(生药浓度)药物组增乳效果最显著,提示中药王不留行可直接作用于奶牛乳腺上皮细胞促进泌乳.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)006【总页数】4页(P45-48)【关键词】王不留行;乳腺上皮细胞;泌乳【作者】李楠;高学军;关力【作者单位】东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;黑龙江农业职业技术学院,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】S853.7中药王不留行(Semen vaccariae)对雌性动物具有通乳、泌乳的特性,但其如何调控泌乳从而发挥其生物学功能尚不清楚。